膜—反向斑点杂交技术检测肺结核患者肺组织和肺泡灌洗液中的结核杆菌

[摘要] 目的 探讨膜-反向斑点杂交技术（RDB）在病理石蜡组织和肺泡灌洗液检测结核杆菌的临床应用价值。 方法 以97例病理石蜡组织、97例肺泡灌洗液为研究对象，分别以膜-反向斑点杂交、实时荧光PCR（RT-PCR）、抗酸染色三种方法检测结核杆菌，对三种方法进行方法学评价。 结果 结核组病理石蜡组织、肺泡灌洗液三种方法检测的总阳性率分别为：抗酸染色为32.8%，RT-PCR阳性率为82.8%，RDB阳性率为89.9%，两两比较差异均有统计学意义（均P < 0.05），对照组三种方法检测结果均为阴性；三种结核杆菌的检测方法的方法学评价，RDB灵敏度（90.6%）、约登指数（0.91）、符合率（93.9%）、阴性预测值（85.0%）均较好。 结论 膜-反向斑点杂交技术在病理石蜡组织和肺泡灌洗液结核杆菌的检测上有很高的临床应用价值，值得临床推广应用。

[关键词] 膜-反向斑点杂交；实时荧光PCR；抗酸染色；结核杆菌；病理石蜡组织；肺泡灌洗液

[中图分类号] R378.911 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2013）11（a）-0014-04

Membrane reverse dot blot hybridization for detection of mycobacterium tuberculosis in the lung tissue of patients with pulmonary tuberculosis and in bronchoalveolar lavage fluid

JIANG Shali1 ZHU Demao1 ZHOU Huashan1 LUO Haijun1 WANG Zhigan1 LI Feng2

1.Department of Pathology， the First Central Hospital of Changsha City of Hu′nan Province， Changsha 410004， China； 2.Red Cross Hospital of Hangzhou City， Zhejiang Province， Hangzhou 310003， China

[Abstract] Objective To investigate membrane reverse dot blot hybridization technique in pathological paraffin tissue and bronchoalveolar lavage fluid detection of mycobacterium tuberculosis clinical application value. Methods 97 cases of pathological tissue and 97 cases of alveolar lavage fluid as the research object， respectively by membrane reverse dot blot hybridization， real-time PCR， acid-fast staining for detection of mycobacterium tuberculosis in three ways， the three methods were evaluated. Results The total positive rate of three methods for detection of tuberculosis group pathological paraffin tissue and bronchoalveolar lavage fluid were： acid-fast staining positive rate was 32.8%， RT-PCR positive rate was 82.8%， RDB was 89.9%， there were significant differences in any two groups （P < 0.05）， the control group of three methods of test results were negative； evaluation method three methods of Mycobacterium tuberculosis， RDB sensitivity （90.6%）， Youden index （0.91）， the coincidence rate （93.9%）， and negative predictive value （85.0%） were good. Conclusion membrane reverse dot blot hybridization technique has very high clinical value in the detection of pathological tissue and bronchoalveolar lavage fluid of mycobacterium tuberculosis， is worthy of clinical application.

[Key words] Membrane reverse dot blot hybridization； Real-time PCR； Acid-fast stain； Mycobacterium tuberculosis； Pathological paraffin； Bronchoalveolar lavage fluid

近年结核的感染逐渐增多，细菌培养为结核确诊的“金标准”，但培养周期过长，阳性率低及生物安全要求较为严格等局限性制约了其临床的推广应用。临床病理则主要依赖抗酸染色、典型干酪样坏死及结核结节，漏诊率较高。寻求灵敏、特异、准确的结核检测方法成为临床研究的重要课题，膜-反向斑点杂交（recerse dot blot，RDB）技术为一种结合基因扩增及分子杂交的新型基因诊断技术，在临床有用于胸水及痰样本的报道[1-2]，本研究对97例病理石蜡组织及97例肺泡灌洗液采用RDB、实时荧光PCR（RT-PCR）、抗酸染色三种方法进行检测比较，旨在探讨RDB技术在病理石蜡组织和肺泡灌洗液检测结核杆菌的临床应用价值。

1 对象与方法

1.1 研究对象

97例病理石蜡组织及97例肺泡灌洗液均来自2010年1月～2013年5月湖南省长沙市中心医院住院患者，其中临床确诊肺结核患者63例设为结核组，男39例，女24例，平均年龄（42.6±8.3）岁，经纤维支气管镜采集肺泡灌洗液及活检肺组织石蜡包埋各63例，另选取同期非结核肺部疾病患者34例为对照，男21，女13例，平均年龄（46.8±8.9）岁，具体包括弥漫性肺炎18例，肺癌12例，肺气肿4例，经纤维支气管镜采集肺泡灌洗液及活检肺组织石蜡包埋各34例，该项研究经湖南省长沙市中心医院伦理委员会通过，两组研究对象均签署知情同意书，在性别及年龄构成上差异无统计学意义（P > 0.05），具有可比性，分别用RDB、PCR、抗酸染色三种方法检测病理石蜡组织及肺泡灌洗液结核杆菌，比较三种方法的检测情况。

1.2 诊断标准

肺结核的诊断参考原卫生部制订诊断标准[3]，结合患者临床症状、X线、纤维支气管、实验室检查及抗结核治疗的有效性确诊。

1.3 方法

1.3.1 抗酸染色镜检

试剂由厦门迈威生物有限公司提供，肺泡灌洗液离心涂片，石腊切片脱腊水洗，石碳酸品红初染，70℃孵育30 min，0.5%盐酸酒精脱色1 min，0.5%亚甲蓝复染30 s，水洗，无水酒精脱水，二甲苯透明，封固。高倍镜检，抗酸阳性菌呈红染，微细杆状，可分布于巨噬细胞内外。

1.3.2 实时荧光PCR

试剂由中山达安基因生物有限公司提供，基因扩增仪为ABI7300，样本预处理严格按试剂说明书操作，扩增条件：93℃ 2 min预变性，93℃ 45 s（变性）、55℃ 120 s（退火、延伸）为一循环，共计40循环（后30循环记录荧光信号），结果判定，CT值< 27为阳性，CT值处于27～30之间为灰区，需重新检测，再次检测CT值≤30为阳性，>30为阴性。

1.3.3 膜-反向斑点杂交

1.3.3.1 标本预处理 采用4倍体积的4%NaOH室温下对研究标本进行液化30 min，15 000 r/min离心5 min，离心半径10 cm，去上清，并加1 mL生理盐水充分吹打混匀洗涤。50 μL 20 g/L蛋白酶K消化，沸水浴10 min灭活蛋白酶K。

1.3.3.2 DNA提取扩增 具体方法见参考文献[2]，试剂由大连宝生物工程有限公司提供，提取液苯酚、异戊醇、氯仿，三者比例25∶1∶24，提取液等体积与标本混合，12 000 r/min离心10 min，离心半径10 cm，取上清与裂解液混合室温1 h，上清裂解液体积比2∶1，裂解液成分与无水乙醇1∶6比例，12 000 r/min离心10 min，离心半径10 cm，弃上清，加入500 μL无水乙醇溶解沉淀，12 000 r/min离心8 min，离心半径10 cm，弃乙醇，加入50 μL灭菌注射用水为扩增模板，不立即扩增可-20℃保存，扩增基因片段为IS6110，引物P1：5′CGT GAG GGC ATC GAG GTG GC3′，P2：5′GCG TAG GCG TCG GTG ACA AA 3′，同批扩增采用蒸馏水为阴性对照保证实验结果有效性，反应体系包括：模板DNA、DNA polymerase、Buffer、dNTPmixture、引物，扩增条件：95℃ 5 min预变性，94℃ 50 s（变性）、59℃ 45 s（退火）、72℃ 50 s（延伸）为一循环，共计38循环，4℃保存。

1.3.3.3 膜芯片检测 试剂由深圳亚能生物公司提供，膜固定探针T1、T2、T3及阳性质控P1、阴性质控N，扩增产物点样58℃杂交2～3 h，经洗膜、显色，放入清水30 min中止显色，研判结果。在阴阳性质控保证实验有效性的前体下，T1、T2、T3任一探针出现蓝色斑点为阳性。

1.4 统计学方法

研究数据统计学处理采用统计学软件SPSS 13.0进行，计数资料以率表示，采用χ2检验。以临床确诊为阴阳性判断标准，对3种方法进行方法学评价，其中灵敏度=[真阳性/（真阳性+假阴性）×100%]、特异度=[真阴性/（真阴性+假阳性）×100%]、约登指数={[真阳性/（真阳性+假阴性）×100%+真阴性/（真阴性+假阳性）×100%]-1}、符合率=[（真阳性+真阴性）/（真阳性+真阴性+假阳性+假阴性）]、阴性预测值（NPV）=[真阴性/（真阴性+假阴性）×100%]、阳性预测值（PPV）=[真阳性/（真阳性+假阳性）×100%]。以P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 三种方法检测结果图

结果显示，结核杆菌出现典型S型扩增，阴性对照无扩增现象（图1、2）；结核结节镜下特点：由上皮样细胞，郎罕巨细胞加上外周局部集聚的淋巴细胞构成的特异性肉芽肿（图3、4）。图4为类上皮细胞和郎罕氏巨细胞；抗酸染色结核杆菌为为红色的略带弯曲的细长杆状菌（图5、6）。

1～9号：结核杆菌；10号：大肠杆菌

图1 膜-反向斑点杂交检测结核图

2.2 三种方法检测结果比较

结核组抗酸染色石蜡组织阳性率为28.5%，经卡方检验分析比较，与RT-PCR阳性率（79.4%）、RDB阳性率（88.9%）差异均有高度统计学意义（χ2=34.5，P < 0.001；χ2=49.40，P < 0.001），RT-PCR与RDB比较意义无统计学（χ2=2.88，P=0.09 > 0.05）；肺泡灌洗液抗酸染色阳性率为38.1%，与RT-PCR阳性率（88.9%）、RDB阳性率（95.2%）比较差异均有高度统计学意义（χ2=36.99，P < 0.001；χ2=48.50，P < 0.001），RT-PCR与RDB比较差异无统计学意义（χ2=2.69，P=0.10 > 0.05）；总阳性抗酸染色为32.8%，与RT-PCR阳性率（82.8%）、RDB阳性率（89.9%）比较差异均有统计学意义（χ2=67.40，P < 0.001；χ2=89.83，P < 0.001），RT-PCR与RDB比较也有统计学差异（χ2=4.08，P=0.043 < 0.05）；对照组三种方法均未检测出阳性。见表1。

表1 三种方法检测结果比较[n（%）]

注：与抗酸染色比较，*P < 0.05；与RT-PCT比较，#P < 0.05；RT-PCR：实时荧火PCR；RDB：膜-反向斑点杂交

2.3 三种方法方法学评价

以临床确诊结核为真阳性性，对照组为真阴性，三种结核杆菌的检测方法的方法学评价见表2，3种方法比较，灵敏度、约登指数、符合率、阴性预测值均以RDB较好。

表2 三种方法方法学评价

注：RT-PCR：实时荧火PCR；RDB：膜-反向斑点杂交

3 讨论

据2008年WHO统计我国的结核发病人数居世界第2位，流行情况较为严重的国家[4]，在我国结核现状呈现高发病率、高耐药率、高死亡率的“三高”特点[5]，痰涂片及细菌培养为肺结核确诊的“金标准”，有研究资料报道[6-7]：两者阳性率均接近30%左右，而大量的痰涂片及细菌培养阴性肺结核患者早期诊断在临床多依赖于根据临床症状的经验性诊断及影像学检查，漏诊及误诊率较高[8]，RT-PCR及RDB技术应用于结核杆菌的检测近年在临床发展较快，相对于传统的检测方法，灵敏、特异，具有较为广阔的应用前景。

RT-PCR是基于荧光共振能量转移及分子标记的基因诊断方法，他将结核的诊断提升到基因水平，方法快速，敏感，但临床有报道存在非特异性扩增的现象[9-11]，RDB技术为一种将生物素标记的探针交联于硝酸纤维素膜（或尼龙膜），在液相环境中与PCR扩增产物特异性结合以检测目标基因片段的基因诊断方法[12-14]，综合了基因扩增、分子标记、核酸杂交及酶联显色等技术[15]，本研究扩增的目的基因为结核杆菌高度保守插入序列IS6110，含1300 bp[16-18]，扩增完成目标基因与膜上生物素标记的探针的特异性结合保证实验的高度特异性，与实时荧光PCR相比较可消除可能存在的非特异性扩增而引起的假阳性结果，在检测的准确性方面有较大的优势。在本研究中，结核组肺泡灌洗液及石蜡组织的结核杆菌检测中，RDB技术的阳性率均高于其他两种方法，尤其相对传统的抗酸染色，统计学差异有显著性，对照组3种方法均未检测阳性结果。3种方法方法学比较，RDB技术在灵敏度（90.6%）、约登指数（0.91）、符合率（93.9%）、阴性预测值（85.0%）均优于RT-PCR及抗酸染色。

研究中发现在结核组中石蜡组织3种方法阳性率均略低于肺泡灌洗液，分析原因，石蜡组织取材的局限性可能是原因之一，有学者认为[19]，蜡块甲醛长时间固定及DNA交联降解会对DNA扩增造成影响，在本研究中RT-PCR及RDB分别有6例及4例石蜡组织结果与肺泡灌洗液检测结果不同。

综上所述，RDB技术在病理石蜡组织和肺泡灌洗液结核杆菌的检测上，相对于传统的检测方法具有灵敏、特异、准确，直观等特点，有较高的临床应用价值，值得临床推广应用。

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（收稿日期：2013-08-05 本文编辑：卫 轲）