白藜芦醇与紫杉醇联合用药对人喉癌Hep―2细胞凋亡机制的研究

[摘要]喉癌是呼吸道肿瘤中最常见的恶性肿瘤之一，在呼吸道肿瘤中高居第二位。白藜芦醇（resveratrol，Res）是一种多酚类物质，可通过抑制细胞内核苷酸还原酶抑制肝癌细胞、胃癌细胞、胰腺癌细胞等肿瘤细胞生长。紫杉醇（taxol，Tax）是红豆杉属植物中一种次生代谢物，可抑制细胞内微管的解聚，对乳腺癌、宫颈癌、卵巢癌等肿瘤有良好的抗肿瘤活性。目前有关白藜芦醇联合紫杉醇用药针对人喉癌细胞株hep-2的作用及其相关分子机制研究还鲜见报道。用白藜芦醇（Res）、紫杉醇（Tax）处理人喉癌细胞株Hep-2，采用CCK-8法检测2种药物对Hep-2细胞增殖的影响，AO/PI染色和JC-1检测Hep-2细胞凋亡，实时定量PCR检测Bax，Bcl-2，PARP，TRIB3，XIAP基因的表达，荧光定量法检测caspase-3，caspase-8活性。结果表明，与Tax，Res单独用药相比，联合组显著增强对Hep-2细胞的抑制作用，且明显减少Tax的用药剂量，增加Bax，PARP，TRIB3的表达，降低Bcl-2，XIAP的表达，促进caspase-3，caspase-8活性。这表明Res，Tax以及其联合药物通过线粒体途径诱导喉癌细胞Hep-2的细胞凋亡。这为进一步研究Res，Tax联合用药治疗喉癌奠定理论基础，且扩大Res，Tax联合用药范围。

[关键词]白藜芦醇；紫杉醇；喉癌细胞株Hep-2；细胞凋亡

[Abstract]Laryngeal cancer is one of the most common malignant tumors in the respiratory tumors， and its incidence ranks second highest in the respiratory tumors. Resveratrol （Res） is a kind of polyphenols， which can inhibit nucleotides can inhibit the growth of liver cancer cells， gastric cancer cells， pancreatic cells and other tumor cells by inhibiting ribonucleotide reductase in the cells. Taxol （Tax） is a kind of secondary metabolites of Taxus chinensis， which has anti-tumor activity for breast cancer， cervical cancer， ovarian cancer and other tumors by inhibiting cellular microtubule depolymerization. But at present the effects of resveratrol combined with taxol on human laryngeal carcinoma cell strain Hep-2 and their underlying molecular mechanisms are rarely reported. After human laryngeal cancer cell Hep-2 cells were processed with resveratrol （Res） and taxol （Tax）， CCK-8 assay was used to evaluate the effect of these two herbs on the proliferation of cancer cells； AO/PI staining and JC-1 were used to detect Hep-1 cells apoptosis； the expression of Bax， Bcl-2， PARP， TRIB3， and XIAP genes was detected by real time quantitative PCR； the activity of caspase-3 and caspase-8 was determined with quantitative fluorescence method. The experimental results showed that compared with Tax， Res medication alone， joint group significantly enhanced inhibition of Hep-2 cells activity， decreased the dosage of Tax， increased the expression of Bax and PARP， TRIB3， reduced the expression of the Bcl-2 and XIAP， and promoted the activity of caspase-3 and caspase-8. The test results showed that compared with the single medication， combined group could significantly increase the inhibitory effect on Hep-2 cells， significantly reduce Tax dosage， increase expressions of Bax， PARP， TRIB3， reduce expressions of Bcl-2， XIAP， and promote activity of caspase-3， caspase-8. This indicated apoptosis of human laryngeal carcinoma cell strain Hep-2 may be induced with Res， Tax， and the combination of these two herbs by mitochondria pathway. It provides valuable clue for further research on combination of Res and Tax for the treatment of laryngeal cancer， and expanding the combined application of Res and Tax.

[Key words]resveratrol； taxol； laryngeal carcinoma cell Hep-2； apoptosis

doi：10.4268/cjcmm20160320

喉癌（carcinoma of larynx）是头颈部最常见的恶性肿瘤之一[1]，在呼吸道肿瘤中居第二位，仅次于肺癌。白藜芦醇具有增强自身免疫力[2]、抗炎[3]、抗菌[4]、抗自由基抗氧化[5]、抗癌[6-7] 、保护心血管[8]等作用。而白藜芦醇的抗肿瘤机制可能是多方面，研究发现白藜芦醇在肿瘤发生的起始、增进和扩展过程中都有较大的抗癌活性[9]，且通过抑制环加氧酶和氢过氧化物酶的活性对癌症发生的3个阶段起到抑制作用[10]。紫杉醇具有独特的抗癌机制和神奇的抗癌功效，被誉为近30年来天然抗癌药物研究领域最重大的发现之一，是继阿霉素和顺铂后的热点抗癌新药，也是当前最热门、最昂贵的广谱抗癌药物，被誉为“晚期癌症的最后一道防线”。紫杉醇的抗肿瘤机制是作用于微管，使细胞有丝分裂停止，最终破坏细胞的分裂周期[11]。已有的研究表明紫杉醇毒性大，诱导化学低敏感性和小鼠的热痛觉过敏，对体内细胞造成损伤，有副作用，容易产生抗药性[12] 。而白藜芦醇对正常的人体细胞毫无损害，具有良好的药理活性和选择性[13]。本研究旨在找到2种药物的作用关系，以便达到增强药物对癌细胞的效果，节约单体药品的使用量，减少对人体的毒副作用，并且对其机制进行初步研究。

1材料

人喉癌细胞株Hep-2细胞，购于川北医学院分子与免疫生物学实验室。

全自动酶标仪（Thermo Varioskan 3001，美国）；My CyclerTM扩增仪（Bio-rad，美国）；冷冻离心机（Eppendorf Centrifuge 5415D，德国）；电子分析天平（BP211D，德国）；凝胶成像分析系统（Bio-rad Universal Hood Ⅱ，美国）；分光光度计（Thermo a Photometer Nanodrop-2000C，美国）；定量PCR仪（Bio-rad CFX96，美国）；CO2恒温培养箱（SANYO MCO175，日本）。

胎牛血清（四季青，杭州）；胰蛋白酶、溴化乙锭（EB）（Sigma，美国）；RNA酶抑制剂，DNA marker，Taq DNA聚合酶，吖啶橙，碘化丙啶，实时荧光定量反转录试剂盒（Takara，日本）；紫杉醇（Tax），白藜芦醇（Res），RPMI 1640基本培养液（Gibco，美国）；RNA提取试剂盒（Biomiga，美国）；Sosofast SuperMix荧光定量试剂盒（Bio-rad，美国）；紫杉醇，白藜芦醇（瑞芬思，中国）；CCK-8试剂盒（Dojindo，日本）；链霉素（Gibco，美国）；青霉素（Gibco，美国）；胰蛋白酶（Amresco，美国）。

2方法

2.1Hep-2细胞的培养人喉癌细胞株Hep-2生长于含10%胎牛血清，100 mg・L-1青霉素，100 mg・L-1链霉素的RPMI 1640培养基中，于37 ℃，5% CO2饱和湿度培养箱中培养，待细胞生长至对数生长期时进行实验。

2.2Hep-2细胞生长曲线的测定取对数期的Hep-2细胞按每孔5×103个细胞（100 μL/孔）接种于96孔培养板中37 ℃，5% CO2的条件下培养。培养6，12，24，36，48，60，72 h后，每孔中加入10 μL的CCK-8溶液，然后37 ℃孵化4 h，酶标仪测定在450 nm处的吸光度。

2.3CCK-8检测白藜芦醇、紫杉醇以及联合组对细胞活性的影响实验分组见表1。将胰酶消化形成的细胞悬液（2×105个/mL）接种96孔板，诱导一定时间后，每孔加入10 μL CCK-8溶液，37 ℃孵化4 h，然后在酶标仪上选择450 nm波长测定吸光度，计算各浓度的抑制率。抑制率方式计算如下[4]：细胞增殖抑制率=（1-A实验组平均值/A对照组平均值）×100%。

2.4AO/PI荧光双染检测白藜芦醇、紫杉醇单体及联合用药对细胞形态的影响取对数期生长的Hep-2细胞按1×104个/mL细胞接种于含灭菌盖玻片的6孔培养板中制作爬片。当细胞生长至80%单层贴壁时，分别用Res（200 μmol・L-1），Tax（5 μmol・L-1），Res（200 μmol・L-1）+Tax（5 μmol・L-1）联合溶液依次加入6孔板中，设定空白对照组。诱导24 h后，将盖玻片用灭过菌的PBS（0.01 mol・L-1，pH 7.4）缓冲液洗涤2次，以3∶1配制的AO/PI染色液染色1 min，加95%乙醇处理10 min，洗净，再用0.1 mol・L-1CaCl2溶液分色1 min，倒放置在载玻片上，用荧光显微镜观察，照相。

2.5JC-1检测线粒体膜电位取对数期生长的Hep-2细胞按1×104个/mL细胞接种于含灭菌盖玻片的6孔培养板中做成爬片。当细胞生长至80%单层贴壁时，分别用Res（200 μmol・L-1），Tax（5 μmol・L-1），Res（200 μmol・L-1）+Tax（5 μmol・L-1）联合溶液处理，设定空白对照组。处理24 h后，加入1 mL JC-1染色工作液，振荡混匀。37 ℃孵育20 min，吸弃上清，用JC-1染色缓冲液（1×）洗涤细胞2次，再加入2 mL RMPI 1640培养液荧光显微镜下观察，拍照。

2.6实时荧光定量PCR检测Bax，Bcl-2，PARP，TRIB3，XIAP的表达从GenBank数据库中检索人Bax（NM-004324）和XIAP（NM-001167）的全序列，引物由Takara公司设计合成。ACTB，GAPDH作为内参基因，引物序列见表2。本实验利用The EZgeneTM Biozol RNA Kit（Biomiga）试剂盒进行RNA提取。按照PrimeScript RT reagent Kit Perfect Real Time （Takara）所提供的说明书在冰上进行RT反应液的配制，按照相关反转录反应条件进行反应，然后进行实时荧光定量PCR进行检测。

2.7caspase-3，caspase-8活性检测取对数生长期Hep-2细胞，用Res（200 μmol・L-1），Tax（5 μmol・L-1），Res（200 μmol・L-1）+Tax（5 μmol・L-1）联合溶液处理，设定空白对照组，分别诱导12，24 h后，收集细胞。加入 100 μL裂解缓冲液，涡旋振荡。然后置于冰上15 min，每5 min涡旋振荡一次。在4 ℃，500×g下离心5 min，取上清液。对上清液用考马斯亮蓝法进行蛋白定量。取10 μL（大约含20～50 μg）蛋白的上清液，加入90 μL检测缓冲液和10 μL Ac-DEVD-pNA，在37 ℃避光反应1～2 h，出现黄色时检测其活性。在酶标仪上选择450 nm波长测定吸光度。根据凋亡诱导的细胞的吸光度与空白对照细胞的吸光度的比值计算相对的caspase-3，caspase-8的活性程度。

2.8统计学处理采用SAS统计分析软件对检测数据进行单因素方差分析。

3结果

3.1Hep-2细胞的生长曲线本实验利用CCK-8法对Hep-2进行细胞连续动态（6，12，24，36，48，72 h）的测定，根据所得吸光度为纵坐标，时间点为横坐标， Hep-2细胞传代之后，经过短暂的悬浮然后逐渐贴壁，缓慢生长随后度过潜伏期，12 h后即进入大量分裂的指数生长期。在细胞生长至饱和密度后，36 h后细胞停止生长，进入平台期，然后衰老凋亡，见图1。

3.2白藜芦醇、紫杉醇以及联合组对细胞活性的影响Tax，Res分别对Hep-2细胞作用12，24，36 h后，细胞均出现生长受到抑制，呈现明显的时间剂量依赖性，见图2。经计算，Tax的半抑制浓度（IC50）为（1.59±0.027 7）μmol・L-1，在5 μmol・L-1时对Hep-2细胞的抑制率达到61.60%。Res的IC50为（87.20±0.339 3）μmol・L-1，在200 μmol・L-1对Hep-2 细胞的抑制率为61.40%。Tax和Res联合用药对Hep-2细胞的作用也呈现明显的剂量依赖性（P

3.3AO/PI荧光双染观察白藜芦醇、紫杉醇及联合用药组诱导不同时间后对Hep-2细胞形态的影响本实验分别选择Res（200 μmol・L-1），Tax（5 μmol・L-1），Res（200 μmol・L-1）+Tax（5 μmol・L-1）作为实验组，设定空白对照组，37 ℃，5% CO2条件下诱导24 h。结果显示，Hep-2细胞经Res（200 μmol・L-1）和Tax（5 μmol・L-1）分别诱导24 h时，可发现细胞间的粘连逐渐消失，细胞体积相比对照组也逐渐变小，部分核质深染橙红色，呈现典型的凋亡形态。Res+Tax联合作用诱导24 h后，其凋亡形态明显优于前两者单体情况，核质全部深染橙红色，核质固缩，并可看见典型的凋亡小体，见图3。

3.4JC-1线粒体膜电位检测结果Hep-2细胞经Res（200 μmol・L-1）和Tax（5 μmol・L-1）分别诱导24 h后，加入荧光探针JC-1后，可发现有部分细胞呈现红色，其他大部分细胞呈现亮绿色；Res+Tax联合组染色后的细胞全部呈现绿色，见图4。这表明在同一时间梯度下，Res+Tax联合组与 Res，Tax单独组相比，Res+Tax联合组更加促进线粒体膜电位下降，在一定程度上可能暗示Res以及Tax对Hep-2细胞通过线粒体膜电位的去极化进而诱导细胞凋亡。

3.5实时荧光定量PCR检测Bax，Bcl-2，PARP，TRIB3，XIAP的表达水平各组总RNA提取样品的A160/A280均为2.0左右，表明RNA纯度较高，未见降解，见图5。Bax基因在Res+Tax联合组的表达量明显高于单体组Res和Tax；与空白对照组相比，实验组Bax的表达量也显著增加（P

3.6caspase-3，caspase-8活性检测考马斯亮蓝法测定蛋白标准曲线为Y=548.48X+1.581，R2=0.999 1。根据曲线对实验过程中提取蛋白进行定量，最后把样品中的蛋白浓度调整为2.0 mg・L-1。结果显示，Res组、Tax组以及Res+Tax联合组作用Hep-2细胞12，24 h后，caspase-3和caspase-8活性与不加药品的对照组比较具有显著增高（P

4讨论

本实验测定了Hep-2细胞分别经不同浓度的Tax和Res单独以及联合用药时对喉癌细胞Hep-2的活性影响。当紫杉醇和白藜芦醇单独用药时，两者对Hep-2细胞的生长均有较高的抑制作用，在设定的药物浓度范围内，前后两者的抑制率分别达到了44.08%～81.86%和44.70%～93.80%，并且呈现出明显的剂量依赖性。当Tax，Res二者联合用药时药品的半抑制率浓度均出现不同程度的降低，IC50由单独用药时的（1.59±0.027 7） μmol・L-1（Tax）和（87.20±0.339 3）μmol・L-1（Res）下降至联合作用时的（0.47±0.016 3） μmol・L-1（Tax）和（38.16±0.124 9） μmol・L-1（Res）。参照Chou-Talalay联合指数法，2种药物联合确实对Hep-2细胞呈协同抑制作用，对细胞的抑制率显著高于单体组。潘洪明等[14]利用Tax和Res联合对胃癌细胞MGC803的活性测定中同样发现，Tax与Res对MGC803的细胞具有协同抑制作用，与Tax，Res单独用药相比，联合用药的应用可以大大减少单体的用药量，这与本实验研究给果一致。

Bax基因属于Bcl-2基因家族，存在于线粒体上，其编码的蛋白与Bcl-2蛋白的同源性有21%，可作为一种细胞刺激和损伤的感受器，参与线粒体凋亡途径的调控过程。大部分的Bax蛋白以单体形式定位于胞浆中，当细胞接收到凋亡信号时，Bax可增加线粒体通透性，线粒体膜发生变化，转化孔（MPTP）开放，释放Cyt C，激活下游caspase的级联反应，细胞凋亡随之发生[15]。在胞内，Bax与Bcl-2可形成异源二聚体或自身同源的二聚体，可作为细胞凋亡信号通道上的分子开关。当Bax过表达时，Bax的相对量多于Bcl-2，形成同源二聚体Bax/Bax的量多于异源二聚体Bcl-2/Bax，表现为促进细胞凋亡；当Bax表达降低时，Bax的相对量低于Bcl-2，形成异源二聚体Bcl-2/Bax的量多于同源二聚体Bax/Bax，表现为抑制细胞凋亡[16]。田景鸣等研究发现白藜芦醇可通过诱导Bcl-2蛋白的减少与Bax蛋白表达增多，触发卵巢癌细胞A2780发生凋亡，并认为这可能是Res诱导卵巢癌细胞A2780凋亡的机制之一[17]。在本实验中，实验组各组的Bax mRNA表达均有增高，其中联合组Res+Tax的表达量最高；Bcl-2基因在Res+Tax联合组中的表达量略高于对照组，这暗示着联合组可能通过促进Bax的大量表达，形成大量的Bax/Bax同源二聚体，从线粒体途径诱导凋亡发生。

Weil M K等[18]首次发现，PARP（poly ADP-ribose polymerase），即聚ADP核糖聚合酶，它是一种DNA修复酶，可作为细胞凋亡的标志，其主要作用是蛋白质如组蛋白、DNA聚合酶、RNA聚合酶等翻译后修饰，有助于DNA单链断裂的碱基切除修复。Stamm C等[19]研究表明，PARP是细胞凋亡核心元件caspase-3的切割底物。在细胞凋亡启动后，PARP可以被剪切成大小2个片段，使PARP羧基端的催化区域与DNA锌指结构分离，丧失DNA修复功能，增强其核酸内切酶的活性可促进细胞凋亡发生。因此，PARP在DNA损伤的修复与细胞凋亡中发挥着重要的作用。在本实验中PARP 的表达量在联合组中最高，暗示着联合组可能通过大大增加PARP的表达量，促进caspase级联反应的激活，随之发生细胞凋亡。

XIAP（X-linked inhibitor of apoptosis protein），即X连锁凋亡抑制蛋白，具有细胞凋亡抑制作用，是人类凋亡抑制蛋白（inhibitor of apoptosis protein，IAPs）家族中最强的凋亡抑制因子[20]，可直接抑制caspases的活性，并能够通过多种途径调节细胞凋亡，如通过NF-κB途径抑制细胞表面受体介导凋亡[21]。TRIB3基因编码的蛋白质是由核因子NF-κB诱导表达的，对NF-κB进行负调节。NF-κB对某些凋亡抑制因子如c-IAP1，c-IAP2有诱导表达作用，是癌基因c-myc的重要调节因子，可对促凋亡蛋白和抑凋亡蛋白的不平衡表达进行调节，与肿瘤抑制蛋白直接作用，执行抗凋亡作用[22]。研究表明，TRIB3可以抑制NF-κB，而XIAP的表达量与NF-κB的表达成正相关[23]，即TRIB3抑制NF-κB，减弱对XIAP诱导表达，从而促进应激诱导细胞凋亡[24]。在本实验中XIAP在联合组的表达量最低，TRIB3表达量最高，表明XIAP表达量减少而TRIB3表达量升高，从而抑制NF-κB的表达，这暗示着联合组可能通过NF-κB途径促进细胞凋亡。

caspase属于半胱氨酸蛋白酶，是引起细胞凋亡的关键酶，能将细胞内蛋白质降解，使细胞走向死亡。caspase-8作为细胞凋亡的启动者之一。为引发细胞死亡，死亡受体DRs（如TNFR-1等）招募具有FADD死亡结构域的Fas相关蛋白，FADD进一步招募caspase-8原酶形成二聚体，激活caspase-8[25]。活化的caspase-8激活caspase级联反应，最终激活caspase-3，caspase-7；或者直接或间接地通过促凋亡蛋白Bcl-2家族成员BID13激活线粒体凋亡途径[26]。caspase-3作为细胞凋亡的执行者之一，有一个大亚基（17 kDa）和小亚基（12 kDa）[27]，其识别位点为DEVD-X（X为任何氨基酸），识别4个连续的氨基酸结构（P4-P3-P2-P1-P1′，P1位必须是天冬氨酸），断裂P1-P1′之间的肽键[28]。caspase-3的激活被称为caspase级联反应的最后一步[29]，通常是上游caspase-9断裂大小亚基之间的连接[27]。caspase-9-caspase-3反应由一些促凋亡分子如线粒体释放的细胞色素C激活，由IAPs家族蛋白抑制[30]。在本实验中，实验组与空白对照组比较，caspase-8与caspase-3活性明显增强，从蛋白水平表明Res，Tax及联合组增强caspase-8与caspase-3活性，进一步激活caspase级联反应，诱发Hep-2细胞凋亡，与前面XIAP表达结果相一致。

本实验从细胞形态、酶活性、细胞相关分子各个方面阐明了以确定白藜芦醇和紫杉醇单独用药以及联合用药时对Hep-2细胞生长的抑制作用及诱导调亡的分子机制，以减少紫杉醇这种化学抗癌药物的用量，降低其对机体的毒副作用，同时为产生紫杉醇耐药性的癌症患者寻找新的治疗方案，为开发喉癌综合治疗方案提供理论依据。

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