辛伐他汀通过抑制Smad7表达的肾保护作用机制探讨

【摘要】 目的 研究阿霉素肾病大鼠肾小管Smad7表达改变与细胞凋亡的关系，并探讨辛伐他汀通过影响Smad7表达和细胞凋亡的肾保护作用机制。方法 建立大鼠阿霉素肾病模型，RT-PCR半定量分析肾皮质中Smad7 mRNA的表达水平，免疫组化分析Smad7蛋白的定位和表达，用TUNEL法分析细胞凋亡。结果 肾病组肾小管中Smad7 mRNA、蛋白的表达均上调，与肾小管上皮细胞凋亡呈正相关。辛伐他汀可抑制Smad7表达上调、减少肾小管上皮细胞凋亡。结论 阿霉素肾病大鼠肾小管Smad7表达增加与肾小管上皮细胞凋亡相关。辛伐他汀可以通过抑制Smad7表达而降低肾小管上皮细胞凋亡而实现肾保护作用。

【关键词】阿霉素肾病；Smad7；细胞凋亡；辛伐他汀

Study of the renal protect mechanism of simvastatin through effect the expression of Smad7

YOU Yan-wu,LIN Xu,WANG Jie,et al.Dept.Nephrology in Affiliated Hospital of Youjiang Medical College for Nationalities,Baise 53300,Guangxi China

【Abstract】 Objective To investigate the relationship between the expression ofSmad7 and apoptosis in the renal tubular of rats with adriamycin nephropathy and study the renal protect mechanism of simvastatin through effect the expression of Smad7 and apoptosis.Methods Animals were randomly assigned to three groups:normal control,adriamycin nephrosis(ADN),and ADN treated with simvastatin(10 mg/kg•d).Expression of Smad7 was evaluated by RT-PCR and immunohistochemistry.Apoptosis was detected by TUNEL method.Results Expression of Smad7 mRNA and protein in ADN rats was significantly upregulated,which showed a positive correlation with tubular cell apoptosis.Simvastatin decreased the level of Smad7.Conclusion The increased expression of Smad7 correlates with tubular cell apoptosis of rats with adriamycin nephropathy.Simvastatin may prevents renal damage through the down-regulation of Smad7 and the reduction of apoptosis.

【Key words】Adriamycin nephropathy;Smad7;Apoptosis;Simvastatin

近来证实他汀类药物在多种肾小球疾病中具有肾脏保护作用，目前认为他汀的有效作用除对胆固醇合成的竞争性抑制外，还在细胞内信号传导途径中执行另外的作用，但是对于他汀类药物在肾小球疾病中的相关作用机制了解不多。研究证实Smads蛋白是转化生长因子-β(transforming growth Factor-β,TGF-β)细胞内信号传导蛋白，其中抑制型Smad-Smad7具有促凋亡作用。然而，Smad7在进行性肾损害时的表达变化以及其与肾组织细胞凋亡关系的研究较少。本研究旨在建立大鼠阿霉素肾病模型，评估肾皮质Smad7的表达水平与细胞凋亡的关系，并探讨辛伐他汀通过影响Smad7表达和细胞凋亡的肾脏保护作用机制。

1 材料和方法

1．1 实验动物模型 清洁级SD雄性大鼠36只，体质量180~200 g，自由进食、饮水，适应1周后，随机分为3组,12只/组：第1组为阿霉素肾病组，尾静脉一次性注射阿霉素(法玛西亚公司产品)7．5 mg/kg; 第2组为辛伐他汀治疗组，同第1组处理后第2天起予辛伐他汀10 mg/(kg•d)灌胃；第3组为正常对照组。第4、8周后，收集24 h尿液，测定尿蛋白排泄量，经心脏取血送全自动血生化分析仪测血清肌酐、尿素氮，称肾重，取肾皮质按下述处理。

1．2 光镜检查 取标本置10%甲醛中固定后制成石蜡切片，行常规HE、PAS染色后于光学显微镜下观察肾脏病理形态学改变。

1．3 RT-PCR 取液氮保存的肾皮质，按TRIzol reagent(Life Technologies公司产品)方法提取总RNA，用MMLV逆转录酶(Promega产品)逆转录为cDNA,于PCRprint扩增仪上扩增。引物由北京赛百盛公司合成，Smad7引物序列：正义5′-GGA GTC CTT TCC TCT CTC-3′,反义5′-GGC TCA ATG AGC ATG CTC AC-3′。以GAPDH为内参照：正义5′-TCC CTC AAG ATT GTC AGC AA-3′,反义5′-AGA TCC ACA ACG GAT ACA TT-3′。PCR反应为94℃ 45 s,50℃ 45 s,72℃ 45 s,共30个循环。PCR产物于2%琼脂糖凝胶电泳，用德国VL凝胶成像及分析系统进行摄像并半定量分析，Smad7产物为130 bp，GAPDH产物为309 bp，以对GAPDH相对值记录结果。

1．4 免疫组化 石蜡切片用SP免疫组化法(SP免疫组化试剂盒购自北京中山公司)测定Smad7蛋白的定位和表达，多克隆兔抗鼠Smad7购自Santa Cruz公司，工作浓度1：50。用同济千屏影像工程公司HPIAS2000型图像分析软件行图像分析，高倍镜下每张切片随机选取5个视野分析肾小管阳性区域的灰度值。

1．5 TUNEL法测定细胞凋亡 按TUNEL试剂盒(德国宝灵曼公司产品)方法测定各组肾皮质的凋亡细胞，光镜下每张切片至少随机选取5个视野计数肾小管上皮细胞凋亡细胞数，记录阳性率。

1．6 统计学方法 实验数据以（x±s）表示，用SPSS11．0统计软件对各组同期的Smad7 mRNA、蛋白水平进行组间方差分析，将Smad7 mRNA、蛋白的表达水平分别与凋亡阳性细胞率作双变量相关分析，P

2 结果

2．1 大鼠生化指标 肾病组尿蛋白排泄明显高于正常对照组，而治疗组尿蛋白低于肾病组(P

2．2 病理形态学变化 肾病组第4周可见足细胞肿胀，轻度系膜基质增生，球囊壁轻度增厚，间质轻度炎性细胞浸润，间质血管高度充血，肾间质小动脉管壁增厚，管腔狭窄，肾小管上皮细胞脂肪变性，小管灶性扩张，蛋白管型多见；第8周可见肾小球毛细血管内红细胞呈缗钱状、系膜细胞轻度增生、足细胞肿胀，部分肾小球有球囊粘连，球囊壁中或重度增厚，间质炎性细胞浸润加重，小管基底膜增厚，肾小管上皮细胞与小管基底膜分离，小管核浓缩，肾小管多灶状萎缩和片状扩张。治疗组病变较肾病组明显减轻。

2．3 Smad7 mRNA及蛋白表达 肾病组Smad7 mRNA表达［4周时为(0．62±0．02）,8周时为（0．74±0．03)］较正常组［4周时为(0．43±0．04，8周时为（0．45±0．03)］明显上调(P

免疫组化分析Smad7蛋白主要表达于肾小管上皮细胞。肾病组表达(4周时为0．41±0．02，8周时为0．44±0．03)较对照组(4周时为0．23±0．03，8周时为0．20±0．03)明显上调(P

2．4 细胞凋亡分析 TUNEL检测凋亡细胞呈棕褐色，以肾小管上皮细胞为主。对照组可见少量凋亡细胞(4周时为0．15±0．02，8周时为0．11±0．03)，肾病组随病程进展凋亡细胞增加(4周时为0．39±0．02，8周时为0．45±0．03，P

2．5 Smad7表达与肾小管上皮细胞凋亡的相关性分析 肾病组肾皮质中Smad7 mRNA、蛋白表达水平均与肾小管上皮细胞凋亡发生率呈正相关(P

3 讨论

在建立的阿霉素肾病大鼠模型中，Smad7主要表达于肾小管上皮细胞。随着肾脏病变进展，Smad7 mRNA、蛋白表达水平均较正常上调。通过TUNEL法检测发现肾皮质肾小管上皮细胞凋亡增多，Smad7表达与肾小管上皮细胞凋亡呈正相关。应用辛伐他汀干预后，Smad7 mRNA、蛋白表达水平均下调，细胞凋亡减少。

进行性小管损伤和间质纤维化的发展代表了导致肾功能不全的最终共同途径。肾小球疾病中小管间质损伤与肾小球病变一样决定着肾功能不全的进展，甚至比小球病变更重要。然而小管间质损伤的病理发生机制仍不清楚。

Smads蛋白是转化生长因子β(TGF-β)超家族细胞内信号传导途径中的一类调节蛋白，根据结构和功能分为R-Smads(receptor-activated Smads)、Co-Smad(common-partner Smad)和I-Smads(inhibitory Smads)。其中I-Smads可负反馈调节TGF-β信号传导，一些研究已证实它可以对抗TGF-β的各种病理作用。Tetada等通过将I-Smads-Smad7基因转导入实验性肾间质纤维化大鼠模型体内而成功地抑制了肾间质纤维化[1]。LiJH[2]等在培养肾小管上皮细胞中发现Smad7可以阻断TGF-β1诱导的R-Smads-Smad2激活。此外，研究发现，Smad7具有促凋亡活性。在培养的系膜细胞中，Smad7可介导TGF-β诱导的细胞凋亡，Smad7反义寡聚核苷酸可防止TGF-β诱导的细胞凋亡[3]。在本实验中，Smad7表达增加与肾小管上皮细胞凋亡呈明显正相关，也提示了Smad7的促凋亡作用。

他汀类药物通过抑制胆固醇合成过程中的限速酶羟甲戊二酰辅酶A还原酶实现其降脂作用。许多研究已证明了他汀类药物可有效减少心血管事件的发生率和死亡率，近来也证实了他汀类药物在多种肾小球疾病中具有肾脏保护作用，目前认为他汀的有效作用除对胆固醇合成的竞争性抑制外，还在细胞内信号传导途径中执行另外的作用。在被动性Heymanns肾炎模型的研究中，他汀类药物可抑制TGF-β1 mRNA的上调[4]。李振江等[5]用辛伐他汀治疗糖尿病肾病患者，结果发现患者血中的TGF-β1水平逐渐降低。李俊等[6]发现辛伐他汀降低糖尿病肾病患者尿TGF-β1水平，由此认为辛伐他汀可通过抑制肾TGF-β1表达而实现肾保护作用。贾忠辉等[7]研究db/db糖尿病小鼠发现辛伐他汀能减少肾小球细胞肥大和细胞外基质增生，并下调TGF-β的表达。该实验结果显示辛伐他汀治疗后，Smad7表达水平均下调，肾小管上皮细胞凋亡减少，小管间质病变减轻。辛伐他汀对Smad7的下调作用可能是通过抑制TGF-β表达。

综上所述，通过对阿霉素肾病大鼠模型的研究，笔者发现肾小管上皮细胞凋亡与Smad7表达增加相关。辛伐他汀可通过抑制Smad7而降低肾小管上皮细胞凋亡而对肾脏呈现保护作用。

参考文献

［1］ Tetada Y,Hanada S,Nakao A.Gene transfer of Smad7 using electroporation of adenovirus prevents renal fibrosis in post-obstructed kidney.Kidney Int,2002,61:94-98.

［2］ LiJH,ZhuHJ,Huang XR.Smad7 inhibits fibrotic effect of TGF-［beta］on renal tubular epithelial cells by blocking Smad2 activation.J Am Soc Nephrol,2002,13:1464-1472．

［3］ Okado T,Terada Y,Tanaka H,et al.Smad7 mediates transforming growth factor-β-induced apoptosis in mesangial cells.KidneyInt,2002,62:1178-1186.

［4］ Zoja C,Corna D,Camozzi D,et al.How to fully protect the kidney in a severe model of progressive nephropathy:A multidrug approach.J Am Soc Nephrol,2002,13:2898-2908.

［5］ 李振江，雷洁，钟芳红，等.糖尿病肾病TGF-β1，IV型胶原水平变化的临床意义及辛伐他汀的治疗作用.第四军医大学学报，2004，25：942-944.

［6］ 杨俊，计振民,何 畏，等.辛伐他汀对糖尿病肾病患者UALB及TGFβ1、IV型胶原和层黏连蛋白的影响.南京医科大学学报(自然科学版)，2006，26：582-584.

［7］ 贾忠辉，刘志红，郑敬民，等.大黄酸和辛伐他汀对db／db糖尿病小鼠脂代谢紊乱和肾脏保护作用的比较.肾脏病与透析移植杂志，2006，15：233-239.