猕猴桃育种生物技术论文

1基因枪法

该方法是一种将外源DNA包被在金粉或钨粉微粒表面，在高压作用下轰击受体细胞或组织而达到稳定转化的方法［16］。Qiu等［62］报道了利用基因枪法成功将CaMV35S转录DHN1基因导入到美味猕猴桃悬浮细胞中。在猕猴桃遗传转化中，也有利用PEG介导法的成功报道，朱道圩等［63］成功的利用该方法将绿色荧光蛋白基因（GFP）转入到了软枣猕猴桃原生质体中。成功获得转基因植株的一个基本条件是选择的植物细胞类型或者外植体可区分整个植株。研究表明，幼叶、叶柄和茎尖组织已被成功用于猕猴桃转化中。一般情况下选择的外植体越幼嫩更容易获得再生植株，而Han等［51］在软枣猕猴桃研究中发现，如果选择太幼嫩的外植体，农杆菌共培养后会出现坏死和褐变现象。因此，有研究者提出要保持猕猴桃外植体在农杆菌共培养条件下的活性和耐性，每3-4周进行体外继代培养必不可少［60］。MS基础培养基也被成功的用于猕猴桃愈伤组织诱导和植株再生［28］。植物生长激素和细胞分裂素的使用主要取决于外植体材料。例如，Fraser等［54］研究发现在中华猕猴桃组织再生中，加入0.1mg/L的噻苯隆（TDZ）和10mg/L的激动素再生效果要明显优于其他细胞分裂素。Wang等［60］研究发现在加入了2mg/L玉米素和3mg/L的BAP培养基中，可以获得更高的毛花猕猴桃再生芽。Kim等［47］利用包含0.001mg/L2，4-D和0.1mg/L玉米素的1/2MS培养基获得了美味猕猴桃再生芽。

2猕猴桃育种进展及其方法

2.1猕猴桃育种主要进展

据统计，截止到2013年，全球猕猴桃面积约为17万hm2，产量242.80万t（数据引自第八届国际猕猴桃会议资料）。从1978-2013年，我国猕猴桃种植面积从不足1hm2增加到了11万hm2，截止到2013年我国猕猴桃年产量达到约123.63万t。这些数据说明由于育种家的多年努力，猕猴桃主产国的栽培面积和产量在继续提高。我国猕猴桃育种取得的新进展主要表现在2个方面：（1）主栽区育成一批优良的新品种，实现了国外品种长期主导我国猕猴桃产业的局面。根据相关文献统计，主要美味猕猴桃品种有（陕西）秦美、（湖南）米良1号、（湖北）金魁、（江苏）徐香、（贵州）贵长、（陕西）翠香、（河南）华美2号、（陕西）金香、金硕（湖北）、（湖北）鄂猕猴桃4号（、河南）中猕1号（、安徽）皖翠（、陕西）秦翠（、四川）川猕1号、川猕2号（、河南）蜜宝1号。主要中华猕猴桃品种有（湖北）金桃、（四川）红阳、（陕西）华优、（湖北）金艳、（湖南）翠玉、（湖南）丰悦、（江西）早鲜、（江西）魁蜜、（江西）金丰、（湖南）楚红（、湖北）武植3号、（四川）金什1号（、湖北）金怡、（湖北）鄂猕猴桃3号、（湖北）金早、（湖北）鄂猕猴桃3号（、湖北）金阳1号、金农1号及（四川）川猕3号和川猕4号。主要雄性授粉品种有（新西兰）汤姆利、（新西兰）马图阿、（湖北）磨山4号及（湖北）超红。其他种猕猴桃品种有：毛花猕猴桃品种‘华特’、软枣猕猴桃新品种‘宝贝星’（四川）、黑蕊猕猴桃新品种‘红宝石星’（河南）和大籽猕猴桃新品种‘金铃’（湖北）。在我国大面积栽培的国外品种有海沃德（新西兰）、布鲁诺（新西兰）、Hort16A（新西兰）［1，64，65］。自1978年以来我国选育出了近100多个猕猴桃优良品种（品系），实际上大面积推广栽培的品种很少。截止到2011年，栽培面积占到全国5%的品种仅有红阳、徐香、秦美和金魁4个［1］。总体来说，大面积推广栽培的品种主要表现是产量和品质较高，而最突出的特点是生态适应性广。（2）育种目标趋于多元化发展。例如，传统的猕猴桃以绿肉果实为主，近年来黄肉和红肉猕猴桃逐渐受到消费者青睐，用中华猕猴桃和毛花猕猴桃杂交育成的黄肉品种‘金艳’已经成功进入欧洲和南美市场；另外，也培育了供观赏的品种，如‘江山娇’和‘满天星’［66］。猕猴桃育种中还存在许多较为突出的问题。总体上可以概括为：育种单位多，组织形式不合理，缺乏有效协作和必要的合作，材料和信息交流不畅通，严重影响了我国猕猴桃大品种和产业的发展水平。具体表现在以下几个方面：一是育种方法和品种单一。目前我国育成的这100多个新品种（系）中，约有95%以上的品种是通过野生、实生选优方法育成的；另外，这些品种中基本上以美味猕猴桃和中华猕猴桃为主，涉及到其他猕猴桃种的很少。二是生物技术应用慢，针对特定性状的分子标记很少，分子标记的开发与猕猴桃育种目标结合不紧密，尚未建立起为育种服务的生物技术平台，标记辅助选择育种技术没有真正在新品种培育中发挥作用。三是新品种审定应进一步规范化。近30多年来全国共育成审定品种数量很多，但大多数品种基本上都是处于“昙花一现”的困窘，真正能够在生产上推广栽培的品种寥寥无几；另外，这些审定的品种中对抗病性（特别是抗溃疡病）等基本上都缺乏鉴定结果，直接影响了品种的推广寿命。

2.2育种方法和育种路线浅析

现有的猕猴桃育种方法主要有：野生选优、实生选优、芽变选种、杂交育种和渐渗育种等［1］。现阶段，我国猕猴桃育种仍然以野生选优和实生选优为主，利用这些方法培育出的品种为推动猕猴桃产业发展作出了巨大的贡献，如秦美、金魁和金桃等；通过实生选优培育的品种有海沃德、红阳、徐香和华优等；也有经过种间杂交育成的品种，如金艳［64］。野生和实生选优存在育种周期长，同时是建立在大量野生资源收集基础上的。因此，如何将野生和实生选优与分子生物学技术结合起来，加速育种进程和定向性是急需解决的一个问题。另外，种间杂交在猕猴桃育种中应用也较多，该方法可以将感兴趣的野生物种农艺性状通过杂交转育到栽培品种中［67，68］。目前已有许多猕猴桃实现了种间杂交育种，主要包括中华猕猴桃、软枣猕猴桃、黑蕊猕猴桃、大籽猕猴桃（A.macrosperma）和狗枣猕猴桃等［36，38，67-75］。某些物种杂交后代虽然由于受精障碍无法获得可育种子，但在猕猴桃种间杂交中已成功获得了一些优良性状，如实现了红色和黄色果肉、高含量VC、绿色和无毛果皮、高含量的可溶性固形物、花结构和颜色［67，68，70，71］。例如，Hirsch等［36］配置了4个种间杂交组合：狗枣猕猴桃×中华猕猴桃、葛枣猕猴桃×对萼猕猴桃、软枣猕猴桃×葛枣猕猴桃、狗枣猕猴桃×美味猕猴桃，流式细胞分析检测结果表明在这些物种间存在广泛的种间可杂交性。近年来，利用体外染色体加倍技术进行育种的研究也有报道。如Wu等［37］利用秋水仙素离体加倍中华猕猴桃染色体进行育种，这是首次成功的将秋水仙素用于猕猴桃多倍体诱导育种研究中，结果表明加倍效率主要受体外培养基和秋水仙素浓度的相互作用。Wu等［76］报道了自然四倍体和人工诱导四倍体中华猕猴桃染色体减数分裂中的配对行为，指出二倍体种质资源可用于四倍体猕猴桃育种中。也有利用其他方法培育新品种的报道，如Mavromatis等［19］从猕猴桃品种“海沃德”中利用系统的孢子体选择方法选育出了一个新品种。合理科学的育种理论和方法对指导猕猴桃育种工作具有重要的意义。基于现阶段相关研究进展，我国猕猴桃的育种方法可以分为：传统育种和现代育种。（1）传统育种即选择具有特定性状的杂交亲本进行人工杂交育种以培育具有某种新性状的优良品种或者经过野生选优和实生选优培育新品种，如Atkinson等［77］对毛花猕猴桃利于剥皮的这一特性进行了分析，并将其用于常规杂交育种实践中；（2）现代育种，也可称为快速育种技术，主要是利用现代生物技术进行标记辅助选择育种，并借助生物统计学进行亲本、后代的有效选择和评价基因型和环境相互作用的影响，如黄宏文［1］提出的猕猴桃基因渐渗育种就是现代育种技术的一个范例。如在自然资源不具优势的新西兰和意大利等猕猴桃主产国，其新品种选育大多采用了大量的人工杂交设计育种程序和分子标记辅助选择育种［1］。例如，Gill等［8］利用RAPD分子标记开发了用于猕猴桃性别决定鉴定的序列特异性扩增区（Sequence-characterizedamplifiedregion，SCAR）标记，这些标记可以用于猕猴桃标记辅助育种选择中，如对杂交后代在苗期剔除雄株，当作为授粉树时用于选择雄株，或者用于确定种植群体的一个合理的雌雄子代比率。从育种路线上可以分为：抗逆育种、品质育种和砧木选择育种等。（1）抗逆育种具体包括抗病、抗旱、抗寒和抗热等育种；（2）品质育种主要包括果实大小和形状、果面毛被、果肉颜色、果实质地、果实风味和营养成分等。基于以上育种方法体系，适应于我国猕猴桃产业发展的育种策略和育种目标可以概括描述为：“以猕猴桃野生种质资源收集和评价为中心，通过传统育种和现代分子生物学技术相结合的方法，培育满足消费者和市场需求的具有新性状的优良品种为目标”。在具体育种实践中可考虑利用的现代技术包括：染色体重组调控、细胞选择、原生质体融合、倍性操作和胚胎培养等（www.plantandfood.co.nz）。此外，新一代测序技术如转录组测序和SLAF-seq技术对分子生物学的研究发挥了巨大的作用，我国猕猴桃野生资源丰富，利用新一代测序技术进行各种优异资源开发，建立大规模的基因组数据库，可加速育种进程，为培育转基因新品种提供丰富的基因资源［78，79］。

3展望

猕猴桃因其富含丰富的营养，已成为人们青睐的水果。而优质的猕猴桃新品种是实现其高品质的保证。因此，针对重要性状的多目标育种应是今后相当长时期内猕猴桃产业发展亟需解决的重要任务。

3.1加强我国野生猕猴桃种质资源的收集、鉴定、评价和利用

野生种质资源中包含着丰富的优异基因，是一个巨大的天然“基因库”，也是新品种选育的主要材料来源。目前主栽的猕猴桃品种基本上都是利用野生资源选育的，如海沃德和秦美。猕猴桃野生种质资源可以考虑从以下几个方面着手开展工作：一是加强野外资源调查工作。野生种质资源调查应是育种工作者坚持的一项常规性工作，当前更多的青年研究者热衷于从事实验室和分子研究工作，而往往忽视了野生资源的收集与利用；二是加强开展野生资源多目标评价筛选和优异基因的发掘。对野生资源的利用不能仅仅局限于品种选育方面，如在以往的抗逆性资源筛选和转基因研究中，选择的研究材料多集中在栽培品种中，将抗逆资源筛选和抗逆基因发掘的重点放在野生植物上更为可行，因为这方面的抗逆资源更为丰富、抗性更强，而且与栽培品种相比，这类野生植株存活需求是第一位的，产量品质是第二位的，生态生理效益在先，只要生存下来，就有机会实现其栽培经济目标。具体来说，在猕猴桃研究中，可从野生资源中鉴定筛选抗旱、抗寒砧木，利用抗猕猴桃溃疡病材料进行抗性基因发掘，为培育转基因品种奠定夯实的材料基础。

3.2加强猕猴桃特异资源的种质创新

通过植物基因工程、种间杂交、胚挽救和花药培养等方法可以实现新种质创新。特别是以猕猴桃野生近缘种为供体，与栽培品种杂交，同时利用“高代回交法”，可以将近缘种中的优异目标基因快速转移到栽培种中。目前，猕猴桃分子研究的目标性状多集中在果实风味、香味、成熟和颜色上；另外，由于溃疡病的大面积爆发，近年来在猕猴桃溃疡病方面的研究也越来越多，而对抗逆性状的研究相对较少。另外，猕猴桃雄性授粉品种特异资源的培育也是一个研究重点，利用野生资源进行雄性品种选育需要注意几个问题：一是选择树体健壮，花量大，花母枝开花数量多，每朵花含有的花粉粒多，花粉发芽率高，花期长的资源；二是选择多种倍性的雄株，以保证与雌性品种的配套，并开展多种雄花与栽培品种的花粉直感效应研究，为生产上栽培品种提供最优的配套雄株；三是在筛选猕猴桃主栽品种专用授粉雄株的基础上，开发花粉加工专用设备组装形成生产线，建设花粉生产工厂。如本单位已经研制出了猕猴桃雄株花粉加工专用设备、制定了花粉生产工艺、生产技术标准、辅助授粉器，该项目成果已在生产中进行了广泛的推广应用。

3.3加强基因组学技术在猕猴桃育种中的应用

生物技术育种取得的系列研究进展，特别是中华猕猴桃‘红阳’基因组测序成果的发表，为实现分子标记辅助选择和不同猕猴桃种质资源有利性状的基因渗入培育新品种奠定了基础，加速了猕猴桃分子育种的进程，给猕猴桃育种提供了新的发展机遇。在猕猴桃基因组学育种实践中，建议可考虑以下几方面工作：（1）功能标记是可用于育种工作的一种理想标记，功能标记的开发是以克隆基因序列、标记与特定性状的关系为前提的，该标记可用于亲本鉴定、育种后代材料的基因检测以及分离世代抗病性和品质性状的选择；（2）利用基因标记开展聚合育种，如聚合抗溃疡病或褐斑病的基因，以增加品种的多抗性和持久性;（3）利用流式细胞仪开展倍性育种，利用不同倍性亲本杂交可以提高结实率，不同杂交组合的杂交亲和性与亲本的基因型有关，特别是母本的基因型，因此在杂交后代进行倍性鉴定开展早期定向选择育种是非常有意义的。

3.4加强猕猴桃生态学研究

生态学是一个广义的概念，而猕猴桃生态学属于相对狭义的范畴，其可以描述为野生猕猴桃种质资源赖以生存的自然生态环境，以及猕猴桃栽培品种适生的气候和土壤等生态环境因子共同构成的一个综合体。随着猕猴桃品种的多样化发展，对新培育品种的生态适应性提出了更高的要求；另一方面，随着全球气候的变暖，水涝灾害时有发生，加上水肥的使用不合理，进一步阻碍了猕猴桃产业的快速发展。因此，提高猕猴桃果园水肥利用效率，实现在现有面积上通过改变果园微生态环境提高其生物学产量是一个亟需研究解决的新课题。相比于苹果等大宗果树而言，猕猴桃科学研究起步相对较晚，研究深度也较浅。今后可考虑从以下6个方面全面、系统、科学的加强猕猴桃基础研究：（1）种质资源和分类：如野生猕猴桃资源调查及其在杂交育种中的应用、特异资源的遗传多样性和种群遗传结构、多倍性遗传多样性及在品种保护中的利用；（2）营养和生理：如微量元素等喷施对猕猴桃品质的影响、土壤障碍因子对果树产量的影响、果实软熟期果皮形态特征变化、淀粉累积和糖分代谢特征；（3）遗传和育种：倍性遗传与多倍体育种、远缘杂交育种选育目标性状新品种、修剪方法对果树光合和果实特征的影响；（4）采后生物学：如外源激素（乙烯和臭氧）对猕猴桃果实储藏期及其蛋白质组的影响；（5）抗虫和抗病：如猕猴桃抗溃疡病、根腐病和病虫害控制；（6）生产、管理和市场：春季修剪时间对猕猴桃产量和质量的影响；溃疡病对猕猴桃企业的影响。

作者：井赵斌 雷玉山 李永武 单位：陕西省农村科技开发中心 陕西省西安猕猴桃试验站 陕西省汉中猕猴桃研究所