耳穴埋针对血管性痴呆大鼠记忆障碍及β淀粉样蛋白表达的影响

[摘要]目的：探讨耳穴改善血管性痴呆(VD)大鼠学习记忆障碍的反应机制。方法：采用4－血管阻断(4－Vesselocclusion，4－VO)全脑缺血再灌注制备VD大鼠模型，随机分为假手术组、正常对照组、模型组、耳针组，针刺耳穴脑、肾后，做免疫组化、行为学检测、图像分析。结果：耳针能显著降低VD模型大鼠脑内顶叶皮层Aβ免疫阳性神经元的细胞数，升高其平均光密度值(P

[主题词]痴呆，血管性／穴位疗法；埋针，皮内针；耳针；淀粉样β蛋白／针灸效应

血管性痴呆(vascular dementia，VD)是由于脑血管疾病和心血管病变的原因，因缺血性、缺血性组织缺氧和出血性脑损害所导致的认知丧失，VD患者有明显的记忆、思维、计算、定向、判断等能力障碍。随着我国人口老龄化进程的加快，VD越来越成为影响中老年人健康和生活质量的常见病、多发病。近年的研究表明，在缺血性脑损伤后，β淀粉样蛋白发生沉积，β可能参与了脑缺血后脑损伤的发生与发展，Aβ可引起学习记忆减退、认知障碍等。越来越多的证据表明，Aβ是各种原因诱发VD的共同通路，是VD形成和发展的关键因素，因此抑制和减少Aβ在脑内的沉积是突破VD治疗的关键环节。本实验通过研究耳针与血管性痴呆大鼠学习记忆障碍及Ap表达的关系，旨在探讨耳针改善VD大鼠学习记忆障碍的作用机制以及对脑内Aβ的调节作用，从而为有效预防和治疗VD提供实验依据。

1材料与方法

1．1动物及分组

青年健康Wistar雄性大鼠，由贵阳医学院实验动物中心提供[合格证批号为SCXK(黔)2002―0001]，体重200～250 g，随机分为正常对照组(对照组)、VD模型组(模型组)、耳针治疗组(耳针组)，每组10只。

1．2动物模型的建立

按4－血管阻断(4－Vesselocclusion，4－VO)方法制作模型。用10％水合氯醛(0．4 mL／100 g体重)腹腔注射麻醉大鼠，常规无菌手术，背侧正中切口，暴露第一颈椎横突孔，烧灼双侧椎动脉，造成永久性闭塞。然后腹侧颈正中切口，分离双侧颈总动脉，穿线备用，24h后，在大鼠清醒状态下，用微动脉夹可逆性夹闭双侧颈总动脉5min，共夹闭3次，每次间隔1h，观察大鼠的意识、瞳孔、角膜反射、翻正反射等变化，并作记录。手术部位施以适量青霉素抗感染，然后缝合，常规饲养观察。

1．3 4－VO成功的检验指标

4－血管完全阻断1min内大鼠意识丧失；巩膜在缺血后几秒钟内变成苍白色；4条血管阻断成功2～3min内，脑电图(EEG)成等位线；翻正反射消失。病理切片示：大脑顶叶皮层区存在神经细胞排列稀疏，细胞周围组织水肿；细胞变性、坏死，出现噬细胞现象；细胞结构变得不完整，有梗死病灶。

1．4耳针治疗

(1)对照组、模型组未给任何治疗。

(2)耳针组：根据华兴邦提供的动物穴位定位方法，用无菌揿针针刺大鼠耳穴“脑”“肾”，并将揿针固定于耳穴1-24h，两耳交替，每天1次，连续治疗3w。

1．5Y－型迷宫学习记忆测试

用Stanes三等臂Y－型迷宫箱测试大鼠学习记忆。将大鼠放入迷宫箱，适应环境3～5 min，然后驱赶至Ⅰ臂起步区，予以电击，大鼠受电击后从起步区直接逃到安全区为正确反应，若逃到无灯光的任何另一臂，则为错误反应，其间休息1 min。连续10次中有9次(9／10)正确为学会，每只大鼠每日上、下午各测试10次，连续8天。大鼠学习记忆成绩分别以其测试达到连续10次中有9(9／10)次正确反应时所需的电击次数表示。

1．6标本采集

治疗结束后，对照组死亡2只，死亡原因为大鼠之间互相撕咬。模型组死亡2只，死亡原因为术后严重缺血。剩余大鼠用10％水合氯醛深度麻醉，开胸暴露心脏，用头皮针带乳胶管从左心室尖经左房室孔进入主动脉，将0．9％NaCl溶液从乳胶管滴入动物的体循环，一般5～10 min后右心房流出的液体基本无色，将灌流液换为4．0％多聚甲醛固定液，在灌注固定液过程中，大鼠颈部逐渐变硬，内脏变黄后，停止灌注，开颅取出脑组织，再用同样固定剂固定3 h，4℃保存。依次脱水，浸蜡，包埋，连续切片(切片厚度为3 tam)，切片分别用HE病理染色，免疫组化检测。

1．7免疫组化测定

采用SABC免疫组化染色法测定，切片常规脱蜡至水，依次人蒸馏水新鲜配制的3％过氧化氢溶液，室温10 min以灭活内源性酶；0．01 mol／L的枸橼酸盐缓冲液(pH 6．0)微波修复抗原20 min；正常山羊血清封闭液室温20 min；滴加适当稀释的一抗(浓度为1：50)兔抗Aβ，4。C孵育过夜；滴加生物素化抗鼠IgG(即用型)，37℃30 min；滴加试剂SABC，37℃20 min。以上各步骤间均用0．01 mol／L PBS(pH 7．2～7．6)冲洗切片，室温2 min×3次。DAB显色，镜下控制反应时间，蒸馏水洗涤终止反应，苏木素轻度复染，梯度酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封片，显微镜观察。经DAB显色，阳性细胞为棕黄色。兔抗Aβ、DAB、SABC免疫组化试剂盒均购于武汉博士德生物工程有限公司。用PBS代替一抗作为阴性对照。

1．8图像分析及统计学处理

用Biomias 99图像分析系统对平均光密度和阳性细胞数进行图像分析。数据采用均数±标准差(　±s)表示，采用SPSS 12．0统计软件包进行统计分析，组间比较用单因素方差分析(one-way ANOVA)。

2 结果

2．1行为学测试结果

VD模型组在术后所需电击次数较对照组明显增加(P％0．05)，表明大鼠在术后空间分辨学习记忆能力发生严重障碍。耳针组所需电击次数较模型组减少(P0．05)，表明耳针治疗后大鼠空间分辨学习记忆能力得到明显的改善。见表1。

2．2 HE染色结果

HE染色见模型组大鼠大脑顶叶皮层区存在神经细胞排列稀疏，细胞周围组织水肿；细胞变性、坏死，出现噬细胞现象；细胞结构变得不完整，有梗死病灶(见图1a～图1c)。

2．3免疫组织化学染色结果

与对照组相比，模型组Aβ阳性神经元细胞数显著升高，平均光密度值降低，差异具有显著性意义(P

结果显示，Aβ免疫阳性神经元主要分布于大脑顶叶皮层、海马等部位，神经元呈锥形、不规则形等，阳性反应物呈棕黄色，定位于细胞膜，细胞核呈阴性。另外，在脑血管壁上也可见Aβ的沉积。对照组大鼠大脑顶叶皮层和海马区有极少量Aβ神经元表达；VD模型组大鼠大脑顶叶皮层Aβ免疫阳性神经元广泛表达于神经细胞胞浆，染色较深；耳针治疗组Aβ阳性神经元细胞数明显降低(见图2～图5)。

3讨论

Aβ是一类由39～43个氨基酸基构成的小分子多肽，来源于脑内的p淀粉样前体产物(APP)，APP过度表达时可促进其异常途径裂解产生大量Ap沉积于脑β具有神经元毒性作用，引起神经元的退变、凋亡，在体外培养还可引起神经元死亡。Aβ对神经元毒性作用主要来自体外试验，不少学者认为Aβ神经毒性作用是聚集依赖的方式或聚集相关毒性，即可溶性Aβ聚集成不溶性Aβ纤丝才具有更强毒性。目前多数学者认为，Aβ是VD各种病理及临床改变的始发因素。Aβ在细胞外的积聚可促进神经细胞骨架的改变，导致损伤。近来的研究发现，Aβ除对细胞具有直接毒性作用外，还可增强或放大各种伤害性刺激如低糖、兴奋性毒性、自由基等细胞损伤效应。邢昂等研究发现，大鼠短暂性不全性脑缺血再灌注损伤后，海马CA1区神经细胞发生迟发性死亡，同时Aβ表达上调，提示Aβ可能在再灌注损伤后海马CA1区神经细胞迟发性死亡过程中起重要作用。Aβ可以增强血管的收缩性，Aβ升高后可通过去甲肾上腺素或其他内源性收缩活性物质导致神经元缺血而死亡。局灶性缺血时，Aβ增多，神经元发生变性坏死。有学者发现脑缺血后脑局部血流降低，Aβ含量增高，加重了神经元的损伤，可能与脑血管病发生后继发血管性痴呆有关。近期有人用铝诱导建立AD大鼠模型，观察到Aβ在大脑皮质、脑血管壁上有较多的沉积，引起了脑血流障碍、脑缺血、脑组织损伤一系列改变，表现为脑功能异常，智力下降。经过治疗后，随着Aβ表达的降低，学习记忆能力亦得到改善(受电击次数减少，潜伏期延长)。

耳针疗法是祖国医学的宝贵遗产之一，具有安全、无毒副作用、易于推广的特点。耳与五脏均有生理功能上的联系，正如《灵枢・口问》所说：“耳者，宗脉之所聚也”。耳针可疏通经络，运行气血，扶正祛邪，调整人体的阴阳平衡，泻其有余，补其不足。现代研究证明，耳穴能抑制神经细胞凋亡、改善脑血流、提高中老年人血浆中SOD活性、降低MDA含量等作用。从中医的角度而言，血管性痴呆主要病因病机为肾精亏损，髓海不充。耳穴脑具有调节大脑皮层兴奋、抑制的双重作用，耳穴肾可益精血、补脑髓、活气血。相关研究已表明针刺耳穴脑、肾能有效改善VD大鼠的学习记忆障碍。

本实验采用4－血管阻断的方法造模，用Y－型迷宫检测大鼠的学习记忆能力，用免疫组化法检测脑内Ap表达水平的变化。实验结果显示，HE染色见到细胞受损现象，并出现梗死病灶，说明本实验造摸是成功的。各组大鼠术前Y－型迷宫学习记忆成绩无显著差异，VD模型组大鼠在术后空间分辨学习记忆能力发生严重障碍。脑缺血后的VD模型大鼠脑血管壁比正常对照组脑血管壁见到较多的Aβ沉积。VD模型组大鼠大脑皮层Aβ的阳性神经细胞表达明显高于对照组，平均光密度值低于对照组，Y－型迷宫学习记忆成绩显著下降。针刺耳穴“脑”“肾”后，Aβ的阳性神经细胞表达明显下降，平均光密度值增高，大鼠空间分辨学习记忆能力得到明显的改善，Y－型迷宫学习记忆成绩显著提高，差异具有显著性意义。提示耳针治疗后Aβ表达降低可能是耳针具有改善微循环、清除自由基、抑制神经细胞凋亡、增强免疫作用，从而恢复神经元对APP代谢的正常调节，阻止Aβ装备成有毒性的聚合体，保护神经元免受Aβ的神经毒性，避免缺血后神经元迟发性坏死，以达到改善血管性痴呆大鼠学习记忆障碍的目的。至于针刺引起Aβ阳性表达增高的机制尚不清楚，有待进一步深入研究。

注：本文中所涉及到的图表、注解、公式等内容请以PDF格式阅读原文。