N—(2—巯基丙酰基)—甘氨酸对成年大鼠缺氧后处理心肌细胞活性氧水平的影响

摘要：目的 观察在再复氧前5min，活性氧清除剂N-（2-巯基丙酰基）-甘氨酸（MPG）对成年大鼠心肌细胞缺氧后处理活性氧水平表达的影响。方法 体外培养成年大鼠心肌细胞，建立心肌细胞缺氧后处理模型，然后将细胞随机分为4组，正常组（N组）、缺氧/复氧组（H/R组）、缺氧后处理组（HPO组）、缺氧-MPG-缺氧后处理组（H-M-HPO组），酶标法观察各组细胞内活性氧水平的变化。 结果 心肌细胞缺氧/复氧组活性氧水平高于正常组（P

关键词：N-二巯基丙酰甘氨酸 缺氧后处理 心肌细胞 活性氧

Abstract Objective To observe the effect of reactive oxygen scavenger N-（2-Mercaptopropionyl）glycine（MPG） on the expression of ROS level inrat myocardial cells after hypoxia post-processing， which proceed five minutes before reoxygenation. Methods Adult rat myocardial cells were vitro-cultured. Then， the hypoxia post-processing model of myocardial cells was established. The cultured cells were randomly divided into 4 groups， which were normal group（N）， hypoxia/ reoxygenation group （H/R）， hypoxia post-processing group（HPO），hypoxia-MPG- hypoxia post-processing group （H-M-HPO）. The variation of reactive oxygen level in the cells of each group was observed by enzyme linked immunosorbent assay（ELISA）. Results The reactive oxygen level in myocardial cells of H/R group is higher than that of N group （P

Key words N-（2-Mercaptopropionyl）glycine hypoxia post-processing myocardial cells reactive oxygen

活性氧（reactive oxygen，ROS） 作为呼吸链的副产品一直被认为是一种毒性分子，然而，随着研究的深入，人们发现ROS是细胞信号通路中的重要中介体，并认为低浓度的ROS是信号介导分子，可以调控多种信号传导通路，从而协调细胞适应环境的变化[1]。 ROS不但能激活抗氧化相关基因的表达还能激活其它转录因子如低氧诱导因子[2]。Tsutsumi 等[3]在大鼠局部心肌缺血再灌注模型和成人心肌细胞缺氧复氧模型上发现，缺血后处理和药物后处理对细胞有保护作用。本研究拟采用ELISA检测心肌细胞缺氧/复氧后细胞内ROS水平及应用活性氧清除剂MPG对ROS水平的影响，推测缺血后处理通过适量释放ROS激活抗氧化途径适应随后再灌注期间产生的大量ROS，可能是缺血后处理心肌保护的重要机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物 健康清洁级雄性SD大鼠，体质量250-300g，年龄16-20W，由第三军医大学实验动物中心提供，证书号：SCXK（渝）2013-0005。

1.2 实验试剂 N-（2-巯基丙酰基）-甘氨酸（MPG）、Ⅱ型胶原酶、MEDIUM199（M199）培养基、层粘连蛋白（Laminin）、乙二醇双四乙酸（EGTA）、肌酸（Creatine）、硫磺酸（Taurine）牛血清白蛋白（BSA）、N-2-羟一酸哌嗪-N-2-乙磺酸（HEPES）均采购于Sigma公司。

1.3 实验仪器 MPA离体心脏灌注装置ALC-B5恒流泵SIGO双通道灌注仪、美国Thermo3111、3131型二氧化碳培养箱、5804型德国Eppendorf高速冷冻离心机、美国Thermo Multiskan Spectrum型全波长酶标仪。

1.4 实验方法

1.4.1心肌细胞分离与培养 参照文献[4]分离方法并加以改进，主要步骤：大鼠麻醉肝素化后，迅速开胸剪下心脏，放入Ca2+液体中，排出心腔血液，然后将主动脉固定于Langendorff离体灌注管口，依心脏质量将流速设置为9ml/min/g，37℃下依次灌注Ca2+液、EGTA停跳液、Ⅱ型胶原酶。取下心脏剪开，然后加入还有1%BSA溶液的Ⅱ型胶原酶充氧条件下震荡致消化。37℃水浴箱中自由沉降，收集细胞。将细胞平铺于6孔板中，此板经过层粘连蛋白37℃，预处理半小时以上。

1.4.2培养心肌细胞 六孔板中加入无血清M199培养基培养4h，换液，重新加入培养基培养20小时过夜。

1.4.3实验分组及处理 实验共分为4组：（1）正常组（N）：37℃95%O2+5%CO2培养箱中持续培养120min；（2）缺氧/复氧组（H/R）：首先经过37℃95%N2+5%CO2培养箱中缺氧45min，再37℃95%O2+5%CO2培养箱中复氧培养1h；（3）缺氧后处理组（HPO）：缺氧45min，缺氧5min，复氧5min，循环3次，复氧1h；（4）缺氧-MPG-缺氧后处理组（H-M-HPO组）：缺氧45min，2mmol/L浓度的MPG处理10min[1]，缺氧5min，复氧5min，循环3次，复氧1h。

1.4.4标本的收集与制备 4组收集细胞达105，用细胞刮将贴壁细胞收集于EP管中，离心、留沉淀，加入裂解液冻存。

1.4.5酶标仪测定各组ROS水平 室温平衡试剂盒，按试剂盒要求在450nm波长测定各孔OD值。

1.4.6统计学分析 用SPSS17.0统计学软件进行分析，实验数据以均数±标准差表示，组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用配对t检验，P

2结果

ROS水平高低 ，其结果显示：心肌细胞H/R组活性氧水平高于N组（P

3讨论

本实验从活性氧水平证明了，缺氧/复氧组活性氧水平高于正常组（P

Nrf2属于CNC转录因子家族，当细胞受到活性氧或亲电子物质攻击时，Nrf2就会和Keap1解离，转位进入细胞核，并以同小Maf蛋白结合的异二聚体形式同抗氧化反应元件（ARE）结合，促进下游编码抗氧化蛋白和Ⅱ相解毒酶基因的表达，从而抗氧化，保护细胞[5]。因此，我们设想缺血和药物后处理可通过释放适量的ROS激活Nrf2-ARE通路，诱导细胞产生内源性抗氧化产物，对缺血心肌产生保护作用。本实验应用活性氧清除剂MPG清除掉设想缺氧后处理前10min爆发性释放的ROS，导致信号转导分子激活Nrf2-ARE通路减少，产生心肌保护作用降低，从细胞内活性氧水平证明了，缺氧-MPG-缺氧后处理组活性氧水平高于缺氧后处理组（P

综上所诉，本实验从细胞水平证实了缺氧后处理对成年大鼠心肌细胞缺氧/复氧损伤具有一定的保护作用；并通过在再复氧前10min用活性氧清除剂MPG处理，使缺氧后处理对心肌细胞产生的保护作用降低，升高其活性氧水平。由于MPG的作用，作为信号转导的ROS被清除了，未能触发信号转导。而缺血后处理的具体保护机制是否与激活内源性抗氧化通路Nrf2-ARE，影响线粒体膜K+-ATP通道开放，抑制Ca2+超载等有关，还需进一步实验研究得以证实。

参考文献

1.Kabe Y， Ando K， Hirao S， et al. Redox regulation of NF-kappaB activation：distinct redox regulation between the cytoplasm and the nucleus[J].Antioxid Redox Signal.2005 Mar-Apr；7（3-4）：395-403.

2.Kevin LG， Novalija E， Stove DF. Reactive oxygen species as mediators of cardiac injury and protection：the relevance to anesthesia practice[J]. Anesth Analg .2005 Nov；101（5）：1275-87.

3.Tsutsumi YM， Yokoyama T， Horikawa Y， et al. Reactive oxygen species trigger ischemic and pharmacological postconditioning： in vivo and in vitro characterization[J]. Life Sci. 2007 Sep 22；81（15）：1223-7.

4.邓胜利，喻田，文钰纾，等.成年大鼠心肌细胞的分离与培养[J].遵义医学院学报，2008，31（6）：587-589.

5.Kobayashi M， Yamamoto M. Molecular mechanisms activating the Nrf2-Keap1 pathway of antioxdant gene regulation[J]. Antioxid Redox signal.2005 Mar-Apr；7（3-4）：385-94.