基于双巯基化合物和纳米金固定生物分子的研究

摘 要：利用自组装方法，将双巯基化合物通过形成金硫键修饰至金电极表面，再利用双巯基化合物的另一个-SH基，吸附纳米金颗粒形成纳米金的膜。运用循环伏安法对此修饰电极进行研究。发现双巯基化合物的最佳修饰时间为2小时；纳米金的最佳修饰速度为6小时；当扫描速度为100mv/s时固定抗体抗原的效果最好；而抗体抗原浓度为1：4时固定效果最佳。

关键词：纳米金 修饰电极 自组装 循环伏安法

一、引言

自组装单分子膜是使用含有各种活性官能团的分子，以化学键的形式与相应的基底（如Au、Ag、Cu、Pt、Si等）相互作用从而形成的自组装膜。目前研究最多的是巯基化合物在金电极表面的自组装及应用分析。由于金表面无自然氧化膜，稳定性好，而且与二硫化合物或硫醇形成的自组装体系具有良好的稳定性，因而以Au-S键为基础的自组装体系往往成为研究的首选体系。

分子自组装技术是80年代新兴的、基于分子自组装作用，在固体表面自然形成高度有序的分子层的方法。该技术具有制备方法简单、膜结构有序、性能稳定等优点，提供了在分子水平上方便地构造理想界面的手段，对实现优良功能材料的分子设计具有指导作用，在生物仿生、生物传感器、、非线型光学等众多领域有广泛的应用前景，已成为当今学术界一项极有意义的研究课题。在众多自组装单分子膜种类中，硫醇类在金基底上的自组装因具有成膜条件较易控制、有序性强、吸附杂质少、选择性高等特点成为了研究最多和最具代表性的体系，在基础及应用研究领域都受到广泛重视。这些技术主要是针对自组装单分子膜形成后稳定状态下结构和性质的探识。但是只有了解和认识溶液中分子自组装的动态的物理和化学过程，研究自组装单分子膜有关的成膜过程的动态信息，才能更好地选择条件并控制膜的制备从而获得高质量自组装单分子膜。总之，自组装技术越来越显示出其不可比拟的优越性。自组装技术提供了分子水平上方便构造理想界面的手段，在、防腐、催化、刻蚀、电子得失反应、分子器件、非线性光学众多领域有广泛的应用前景，从而成为近年来界面化学与材料化学领域研究的特点。

近年来，以纳米粒子构建各种纳米结构功能膜越来越受到人们的青睐。纳米尺寸的金颗粒具有比表面积大、吸附力强、生物相容性好等物理化学特性，它在材料学、电子学、生物医疗以及临床诊断等研究领域均有重要作用。巯基自组装膜是近年来发展的一种新型有机超薄膜，它基于硫原子与金属的强相互作用，成膜容易，制备简单，稳定性和有序性高，而且分子另一端可以带上不同的活团以适用不同的修饰电极的要求。在免疫传感器的研究中，金电极表面上以硫醇分子的自组装应用较多，其固定途径主要是选择合适的功能团的硫醇进行自组装，然后通过活团固定抗体来达到生物分子的固定。该文结合近些年来发展的纳米金技术，先在金电极的表面修饰一层双巯基化合物，再通过纳米金与双巯基化合物中的另一巯基的共价键作用，组装一层纳米金。然后利用纳米金比表面积大、对蛋白质的强亲和性实现羊抗人IgG抗体分子的固定。由于抗体自身带有巯基，而巯基与金之间存在疏水相互作用和形成硫-金键，金纳米颗粒具有良好的生物相容性及很强的表面吸附能力，由此形成的纳米金层用于固定免疫组分及抗体和抗原的应答反应，因而用作免疫实验中合适的传感界面。其基本原理分成三步：第一步金电极与双巯基化合物通过形成金-硫共价键将双巯基化合物修饰在金电极表面，第二步纳米金颗粒与双巯基化合物的另一巯基结合将纳米金修饰在金电极上，第三步上述过程形成的自组装膜包被抗体，第四步抗体与抗原发生免疫反应。

二、正文

1.金电极的预处理

将待修饰的金电极用5#金相砂纸打磨，然后用氧化铝研磨膏在BAS抛光布上抛光成镜面，在1：1硝酸溶液中浸泡30分钟，最后用乙醇和二次蒸馏水各超声清洗2次，每次2分钟，即可得到表面清洁的裸金电极。将处理好的金电极浸入90℃的Piranha溶液（由浓硫酸与双氧水以7：3的比例制成）中10min进行活化处理。再分别用二次蒸馏水和无水乙醇超声清洗2次（每次5min），处理后的电极浸入无水乙醇中备用。

2.双巯基化合物的修饰

将处理好的电极浸入装有双巯基化合物溶液的微型塑料小试管中，置于低温环境下，并且将此装置与周围环境隔离。（因为双巯基化合物易挥发影响修饰的效果）浸泡2个小时后，取出用二次蒸馏水清洗干净，再在水中超声10秒，除去物理吸附的双巯基化合物分子，晾干后即可得到双巯基化合物分子层修饰的金电极。

3.双巯基化合物结合纳米金的修饰

将组装了双巯基化合物的金电极浸入装有纳米金溶液微型塑料小试管中，置于低温环境下，并且将此装置与周围环境隔离。浸泡大概6小时后，取出用二次蒸馏水清洗干净，再在水中超声10秒，除去物理吸附的纳米金溶液，晾干后即可得到双巯基化合物结合纳米金的修饰电极。

4.修饰双巯基化合物最佳时间的确定

用电子天平称取K3Fe（CN）61.6463g，K4Fe（CN）62.1119g放入一清洗干净的50mL小烧杯中加入少量蒸馏水搅拌溶解，然后放置500mL容量瓶中，冲洗玻璃棒与小烧杯一两次然后定容至刻度线即配制成电解质溶液500mL，两物质的浓度都为0.1mol/L。在此电解质溶液中插入三电极体系，接通电路后，在100mv/s的扫速下，电位范围-0.6～0.9v之间进行循环扫描，直至得到稳定重现的循环伏安图，达到活化电极表面的效果，记下阳极峰电流值。

5.改变修饰双巯基化合物时间参数

按照上述金电极上双巯基化合物的修饰方法修饰双巯基化合物，要求改变修饰的时间2h、4h、6h、8h、10h。而固定纳米金的修饰时间2h（此时间为任意选择的，但要求大于等于两小时）。记下五次修饰完纳米金后的循环伏安图，并且观察峰电流的变化情况。（每做完一次全过程的修饰后都必须将电极清洗干净）

6.修饰纳米金最佳时间的确定

在配制好的电解质溶液中，插入三电极体系（金电极必须用Piranha溶液清洗干净），接通电路后，在-0.6～0.9v之间进行循环扫描，记下峰电流值，观察电极是否清洗干净。然后修饰双巯基化合物，其时间即为最佳双巯基化合物的修饰时间。修饰完双巯基化合物之后，变化纳米金的修饰时间2h、4h、6h、8h、10h。记下五次修饰完纳米金后的循环伏安图，并记下峰电流的变化情况以及峰电流最高时纳米金的组装时间。（每做完一次全过程的修饰后都必须将电极清洗干净）

7.抗体的包被与最佳抗体浓度的选择

在1mg抗体中，加入1mLPBS溶液（4gNaCl、0.1gKCl、0.72gNa2HPO4、0.12gKH2PO4混合溶解加水稀释至500mL，调PH值为7）制成抗体溶液。然后用微量进样器取出5uL抗体放入一微型的小试管中，再用微量进样器吸取5uL蒸馏水与抗体混合配成1：1的抗体溶液。在修饰了双巯基化合物与纳米金的金电极表面上，滴上1：1的抗体溶液。在室温下固定大概40min以后，将其用蒸馏水清洗干净，然后以PBS溶液作为电解质测循环伏安图。同理配制1：2、1：3、1：4、1：5四个浓度的抗体溶液，并测循环伏安图。观察出现最高峰时抗体的浓度。（此浓度就为最佳抗体浓度）

8.最佳扫描速度的选择

以金电极为工作电极，依次修饰双巯基化合物（2小时）、纳米金（6小时）、抗体浓度为1：4、包被抗体30min后，在PBS溶液中，当扫速从50mv/s～100mv/s改变时，峰电流与扫速呈线性关系，但当扫速超过100mv/s时扫描图形极其不稳定性并且可能出现无响应情况。

9.抗原的包被

将电极清洗干净后，用最佳修饰双巯基化合物的时间修饰好双巯基化合物，然后用最佳纳米金修饰时间固定好纳米金。接着配制最佳浓度的抗体包被在此电极上，再滴上与抗体浓度相同的抗原溶液，测其最终循环伏安图。

三、结论

利用自组装技术将双巯基化合物与纳米金修饰在金电极表面制成良好的自组装膜修饰电极，并将其用于抗体抗原的研究。研究表明，在0.1mol/L的铁氰化钾与亚铁氰化钾溶液中，当双巯基化合物的修饰时间为2小时、纳米金的修饰时间为6小时、在100mv/s的扫描速度下，获得最佳的电极响应效果。制成的自组装电极在0.1mol/LPBS溶液中固定的抗体浓度（抗体质量对蒸馏水体积）为1：4时，固定效果达到最佳。

参考文献

[1]唐平等。邻氨基酚在硫堇分子自组装膜修饰金电极上的电化学行为及其测定﹝J﹞分析科学学报，2002，18（4）：269～272.

[2] 孙伟等。巯基乙酸自组装膜修饰金电极的制备与电化学表征﹝J﹞青岛科技大学学报，2005，26（3）：189～192.

[3] 桂学琴等。混合自组装层纳米金修饰电极制备及电化学行为﹝J﹞安徽大学学报，2006，30（5）：69～73.

[4] 龙姝等。基于巯基化合物和纳米金自组装技术固定化方法的研究﹝J﹞湖南大学化学化工学院，2003，23（1）：17～25.

[5] 方程、周性尧。自组装研究进展及其传感器技术中的应用﹝J﹞分析科学学报，2003，19（1）：81～85.

[6] 吴迪、吴健。金硫键自组装生物分子膜﹝J﹞化学通报，2004（2）：132～137.

[7] 傅崇岗等。半胱氨酸自组装膜修饰电极的电化学特性﹝J﹞物理化学学报，2004，20（2）207～210.