悬浮培养法分离人前列腺癌PC―3细胞系类干细胞的实验研究

摘要：目的 从人前列腺癌PC-3细胞系中分离鉴定前列腺癌干细胞。方法 分别用含血清及无血清培养基培养前列腺癌细胞系PC-3细胞，采用流式细胞术检测细胞中前列腺癌类干细胞的比例。结果 PC-3细胞可以在无血清培养液中生存并形成可以稳定传代的悬浮细胞球，细胞中CD44+、CD133+及SP细胞比例均显著高于PC-3贴壁细胞的比例。结论 通过无血清悬浮聚球培养可以从PC-3细胞中简便、高效地分离出前列腺癌类干细胞。

关键词：前列腺癌；悬浮培养法；干细胞

前列腺癌是男性最常见的恶性肿瘤之一，通过手术切除、放疗和内分泌治疗等。传统治疗手段虽然可以获得较好的早期疗效，但并不能完全阻止前列腺癌的进展和复发。肿瘤干细胞（tumor stem cells，TSC）被认为是肿瘤发生、发展、转移和复发的根源[1]。已有学者分别从乳腺癌和脑肿瘤等实体瘤中成功分离出相应的TSC。本文采用添加了生长因子的无血清培养基培养前列腺癌类干细胞，再通过流式细胞仪检测其中具有干细胞特性的阳性细胞比例，并进一步鉴定其增殖等特性，从而为进一步深入研究人前列腺癌干细胞（human prostate cancer stem cell，hPCSC）奠定基础，为前列腺癌的临床诊治提供新的思路。

1资料与方法

1.1一般资料 人前列腺癌PC-3细胞购自中国科学院昆明细胞库。含血清培养基（serum-supple-mented medium， SSM）为含10%特级胎牛血清（中国BD公司）的DMEM/F12（1B1，美国Invitrogen/Gibc公司）培养基，并添加2 mmol/L L-谷氨酰胺（美国Sigma公司）；无血清培养基（serum-free medium， SFM）为不含胎牛血清的DMEM/F12（1B1）培养基，并添加2 mmol/L L-谷氨酰胺、人表皮生长因子（human epidermal growth factor，EGF）、人碱性成纤维生长因子（human basic fibroblast growth factor，bFGF）等。流式细胞仪（美国Becton Dickinson公司）、全自动荧光酶标仪（美国Thermo公司）等均由中科院昆明动物研究所提供。

1.2方法

1.2.1前列腺癌PC-3细胞的培养 将PC-3细胞接种于50 mL玻璃培养瓶，添加SSM，在37℃、5%CO2饱和湿度培养箱中培养。

1.2.2前列腺癌类干细胞球的培养分化 将处于对数生长期的贴壁细胞进行消化、重悬于SFM中，每个培养皿悬浮培养1×104个细胞，每天间断摇动培养皿，以阻止细胞贴壁，半量换取培养皿中的培养液，更换1次/2～3 d。待培养皿中细胞增殖、形成悬浮细胞球后进行收集，吹打成单细胞悬液并按1∶2传代。分别于细胞接种后5 d、10 d、15 d统计直径超过60 um的悬浮细胞球数目，选取5个连续视野，用平均法计算PC-3悬浮细胞球的形成率。每2～3 d向形成悬浮细胞球的SFM中滴加FBS，在SSM和SFM中交替培养PC-3成球细胞，观察并记录PC-3成球细胞的生长方式。

1.2.3流式细胞学分选CD44+、CD133+及SP细胞 以PC-3悬浮成球细胞为实验组，以PC-3单层贴壁细胞为对照组。将两种细胞重悬为单细胞悬液，进行染色。应用荧光激活细胞分选法和紫外光激发后双波长分析法检测CD44+、CD133+及SP细胞比例。染色严格依照厂商说明书上标示的操作流程。

1.3统计学分析 采用SPSS17.0软件包进行统计学分析。计量资料用均数加减标准差（x±s）表示，计数资料用频数（n）或率（%）表示，P

2结果

2.1前列腺癌类干细胞球的形成 将前列腺癌PC-3细胞接种于SFM后，大多数细胞呈悬浮生长状态，发生凋亡的细胞为极少数。接种3 d后少量体积较小的肿瘤细胞集成球团，球团大小不等，由5～15个PC-3细胞组成，圆形、具有折光性，结合松散。5～6 d后，悬浮的肿瘤细胞球团增多增多，细胞间结合较紧密。培养1 w后，细胞球团的变成圆形，细胞球团上有新生细胞生长，出芽方式生长为主。约7 d传代，传代后的细胞约4 d后形成新的不规则细胞球，以后逐渐变得规则。

2.2 PC-3悬浮成球细胞的自我更新与分化 收集PC-3悬浮细胞球，吹散、重悬为单细胞悬液后再次接种于SFM中，5～7 d后仍可形成细胞球。经连续传代，细胞球形成率基本稳定（P>0.05）。在SFM中滴加FBS后细胞球变小，底部边缘细胞从细胞球中贴壁快速生长，7 d后基本上看不到细胞球，完全显示为贴壁生长的单细胞。

2.3 PC-3悬浮成球细胞中CD44+、CD133+细胞和SP细胞的比例 统计结果显示，PC-3悬浮成球细胞CD44+、CD133+细胞的比率为9.62%，SP细胞比率为2.19%，均高于贴壁细胞，差异具有显著性（P

3讨论

随着环境的污染，前列腺癌的发病率呈上升趋势，其病死率也在逐年上 升[2]。前列腺癌的治疗以手术切除为主，结合放疗和内分泌治疗，有一定的疗效，但部分前列腺癌进展为雄激素非依赖性前列腺癌（androgen independent prostate cancer，AIPC），目前临床尚无有效的治疗方法，大量文献证实前列腺癌干细胞是引发雄激素非依赖性前列腺癌的原因之一[3]。肿瘤干细胞可自我更新、多向分化和无限增殖，是形成肿瘤的起始细胞并维持肿瘤的生长，其对化疗、放疗均不敏感[4]。现有的治疗手段只以杀灭前列腺癌细胞，无法杀灭前列腺癌干细胞，导致前列腺癌继续进展。并且前列腺癌干细胞比例极低，分化快，缺乏特异性标志物，严重阻碍了对其表型、功能及遗传学特征的深人研究。

本研究通过将前列腺癌PC-3细胞置于SFM中培养，发现只有少数未分化的前列腺癌PC-3细胞能形成前列腺癌类肿瘤干细胞球团，而大部分已分化的前列腺癌PC-3细胞相继凋亡；培养时间越长，前列腺癌干细胞球团呈增大状态，7 d传代后可继续增殖，形成新的细胞球，证明前列腺癌类干细胞可自我更新及增殖。CD44+和CD133+是前列腺癌干细胞的特异性标志物。我们通过检测PC-3悬浮成球细胞CD44mRNA和CD133mRNA的相对表达量分别是PC-3单层贴壁细胞的数倍，提示成球细胞中富集了前列腺癌干细胞。SP细胞存在于多种成体组织、胚胎细胞及肿瘤细胞中，具有自我更新和多向分化潜能，是一种干细胞样的细胞群，可以在体内分化成不同组织类型的细胞。分选SP细胞分选可以分离和鉴定肿瘤干细胞，不需要特定的细胞表面标记物。本研究中，SP细胞比率为2.19%，和Oates（2009）等[5]研究结果基本一致。

综上所述，采用悬浮培养法分离人前列腺癌PC-3细胞系类干细胞，简便、高效，可进一步研究前列腺癌干细胞生物学特性，为临床诊断及治疗前列腺癌提供实验室依据和帮助。

参考文献：

[1]Wang G， Wang Z， Sarkar F H， et al. Targeting prostate cancer stem cells for cancer therapy[J].Discov Med，2012，13（69）：135-142.

[2]上海市疾病预防控制中心.上海市市区1983-2008年恶性肿瘤发病率[J].肿瘤，2011，31（12）：1115.

[3]Yu C， Yao Z， Jiang Y， et al. Prostate cancer stem cell biology[J].Minerva Urol Nefrol，2012，64（1）19-33.

[4]Ottinger S， Kloppel A， Rausch V， et al. Targeting of pancreatic and prostate cancer stemcell characteristics by Crambe crambe marine sponge extract[J].Int J Cancer，2012，130（7）：1671-1681.

[5]Oates JE， Grey BR， Addla SK， et al. Hoechst 33342 side population identification is a conserved and unified mechanism in urological cancers[J].Stem Cells Dev，2009，18（10）：1515-1522.编辑/肖慧