罗格列酮体外抗结肠癌作用的实验研究
时间：2022-08-10 05:59:28
方法：现选取2012年10月至2013年10月在我院进行结肠癌治疗的40例患者作为研究对象，分别对其进行MTT比色法、流式细胞仪、TUNEL法、透射电子显微镜、免疫细胞化学等方法观察细胞的凋亡情况。
结果：实验表明，ROZ的浓度与结肠癌细胞的凋亡成正比例关系。
结论：罗格列酮能够克制结肠癌细胞的生长，为结肠癌的临床治疗奠定了理论性的基础。
关键词：罗格列酮结肠癌实验研究
Doi：10.3969/j.issn.1671-8801.2014.01.002
【中图分类号】R4【文献标识码】A【文章编号】1671-8801（2014）01-0002-01
在众多的恶性肿瘤中，结肠癌的发病率和死亡率都比较高，常规化疗对它而言并没有明显的效果，所以寻找到副作用小、效果好的新药物对于结肠癌病症来说是迫在眉睫的大问题。本文选取2012年10月至2013年10月在我院进行结肠癌治疗的40例患者作为研究对象，对其给予罗格列酮体外治疗，具体情况现报道如下。
1材料与方法
1.1试剂及仪器。本组资料共计40例，均为2012年10月至2013年10月在我院进行结肠癌治疗的患者，年龄34～68岁，平均48.3±2.5岁，所有患者入院时经检查全部属于结肠肿瘤。
1.2方法。
1.2.1MTT比色法。用HT-29细胞在有96孔的平地培养板上接种，培养1天。干预组RoZ（浓度为80、40、20及10umol/L），对比组5-FU（50umol/L），分别在24、48、72h干预后，把MTT20 umol/L（5mg/ml）加入每个孔中，培养6小时后结束并弃掉清液，把DMSO 200ul加入各个孔中，经过10分钟的振荡、摇匀，用酶联免疫检测仪测量出吸光度[1]。
1.2.2流式细胞仪。经5-FU与不同浓度的RoZ处理后，收集细胞105*5个，按照试剂盒的操作说明，把悬浮细胞混匀，然后加5ul的PI，搅拌均匀，在室温下让其进行15分钟的避光反应，通过流式细胞仪检查测试细胞凋亡情况。
1.2.3TUNEL法。首先制作细胞爬片，用ROZ（40umol/L）和5-FU对结肠癌细胞干预48小时，设置对照组，检查与测试细胞凋亡情况。阴性凋亡细胞（细胞膜、细胞质不清楚棕黄色的颗粒或者没有着色），阳性凋亡细胞（细胞核着色为棕黄色），在每张细胞爬片上各选取10个阳性凋亡细胞和总细胞数，计算AI（凋亡细胞比率）。
1.2.4透射电子显微镜。依据MTT和流式细胞仪实验，可以发现ROZ（80、40umol/L）能够明显促使HT-29细胞凋亡，因此在检测中，取ROZ和5-FU对HT-29细胞进行干预，设置对照组，48小时后，用浓度为3%、pH值为7.4的戊二醛在4℃下固定收集到的所有细胞30分钟，做成电子显微镜的常规的标本，再进行双铅染色，然后在透射电子显微镜下进行观察。
1.2.5免疫细胞化学。制作细胞爬片，用ROZ对Bax和Bcl-2蛋白的表达的HT-29细胞干预48小时，设置对照组。4℃下，按照SP-9002免疫组化的试剂盒说明，把适度稀释过的Bcl-2及Bax多克隆抗体孵化培育一夜后，在37℃下，用生物素标记的二抗孵化培育30分钟，然后加入链霉卵白素（辣根过氧化物经酶标记过），最后搜集DAB上的数据（Bcl-2及Bax的表达水平）并在光学显微镜下利用图像分析后计算其灰度值。
2结果
2.1MTT比色法结果。不同浓度ROZ会抑制HT-29细胞的生长，并受浓度和时间的影响，时间越长、浓度越大对细胞的生长产生的抑制作用就越大。
2.2流式细胞仪结果。HT-29细胞经过48小时不同浓度Roz（80、40、20、10umol/L）与5-FU处理，其凋亡的百分率为50.89%、41.02%、31.94%、19.56%、7.43%，对照组为5.23%，因此ROZ浓度与结肠癌细胞的凋亡成正比。
2.3TUNEL法结果。HT-29细胞的凋亡率AI对照组为4.78%，ROZ（40umol/L）19.02%，5-FU31.94%，因此ROZ能够促进结肠癌细胞的凋亡。
2.4透射电子显微镜结果。经过ROZ与5-FU干预后的HT-29细胞，呈现明显的凋亡的图像，而对照组却没有明显的凋亡。因此ROZ能够促进结肠癌细胞的凋亡。
2.5免疫组织化学结果。由ROZ（40umol/L）处理后的Bcl-2及Bax的表达灰度分别为139.8±3.96、103.2±2.98，对照组的表达灰度分别为97.9±1.34、139.9±2.21。两组对比，经ROZ处理过的细胞Bax表达加强，而Bd-2表达削弱。
3讨论
据相关研究显示PPAR，配体在抑制肿瘤细胞的生长速度上能够起到积极的作用，已成为研究领域的热门，如其中的罗格列酮就能够抑制结肠癌细胞的生长，只是它的作用机制目前还比较含糊。机体的自稳状态需要细胞凋亡来维持。目前使用的抗癌药中很多是会引起癌细胞凋亡的，诱导肿瘤细胞凋亡也许会达到抗癌的目的[2]。MTT比色法实验数据显示ROZ能够抑制结肠癌症患者的癌细胞生长，其的浓度、时间与结肠癌细胞生长成反比。
在抗癌药物的评价指标中细胞凋亡也是其中的一项。通过电子显微镜的图像来判断细胞是否凋亡是非常可靠的，透射电子显微镜实验数据显示经过ROZ与5-FU干预后的HT-29细胞，呈现明显的凋亡的图像。并且在流式细胞仪与TUNEL法的实验数据显示ROZ浓度与结肠癌细胞的凋亡成正比，由此推断ROZ之所以抑制结肠癌细胞的生长是因为其能够引起细胞凋亡。
在免疫细胞化学实验数据显示Bax表达加强而Bcl-表达削弱，证明ROZ能够诱导结肠癌细胞的凋亡。通过以上的研究可以证明罗格列酮能够克制结肠癌细胞的生长，为结肠癌的临床治疗奠定了理论性的基础。
参考文献
[1]吴柯，何百成，周歧新.罗格列酮对人结肠癌Lovo细胞增殖的抑制作用及其机制[J].中国生物制品学杂志，2011，24（3）：1276-1279
[2]李，杜秉娜，张嵘，等.山柰酚对人结肠癌SW48细胞增殖的抑制作用[J].沈阳科大学学报，2009，26（9）：727-730
