核酸酶催化放大传感体系的设计及其在铅离子比色检测中的应用

摘要：基于817 DNA酶的催化切割特性和类辣根过氧化物酶DNA酶的氧化还原反应催化特性，发展了一种新型核酸酶催化放大传感体系，并用于Pb2+的比色检测。考察了K+浓度，pH值及反应时间对检测体系的影响。ABTS吸光度变化与Pb2+浓度在5.0～100 nmolL范围内呈良好的线性关系，检出限为3.0 nmolL。此外，因Pb2+酶的特异性，本方法对Pb2+具有良好的选择性。

关键词：DNA酶； 比色检测； 催化放大； 生物传感； 铅离子

1引言

当前，重金属污染仍然是一个全球性问题，特别是在发展中国家，已对人体健康造成了重大伤害[1]。我国规定：饮用水中Pb2+含量不得高于50 _SymbolmA@_gL。目前，Pb2+的检测方法主要有双硫腙比色法、原子荧光法[2]、原子吸收光谱法[3]、气相色谱法、离子交换色谱法、阳极溶出伏安法、微分电位溶出法和极谱法等仪器分析方法[4]。这些方法一般操作复杂、仪器价格较高、且灵敏度有待提高。近年来，许多研究者致力于发展Pb2+检测新方法，如基于生物分子及纳米材料的生物传感方法等[5]。然而这些方法或多或少的存在一些缺陷，使之广泛应用受到了限制。

核酸、核酸酶探针易于合成，性质稳定，使用方便，已得到广泛的研究和应用[6]。对于核酸探针，具有代表性的如核酸适配体（Aptamer）[7]， 发夹结构的分子信标[8]， 以及其它基于DNA构象变化的DNA生物探针[9]。核酸酶是通过体外选择（In vitroselection）得到的一类新型功能核酸[10]。不同的DNA酶可以催化不同的化学反应，包括DNA或RNA的切割连接反应、磷酸化、氨基磷酸酯键的切割等。与蛋白酶相比，DNA酶具有高稳定性，在生物化学和药物领域具有广阔的应用前景。许多DNA酶催化活性需要依赖于特定金属离子的辅助，从而为应用于特定金属离子的检测提供了可能。利用这种特性的生物传感检测已有报道[11～13]。此外，另一种让人感兴趣的DNA酶是由G四股螺旋超分子结构结合血红素（Hemin）而成[14]。它具有过氧化物酶的催化活性，能够催化氧化双氧水介导的底物体系，如鲁米诺，ABTS（2，2联氮二（3乙基苯并噻唑6磺酸））和TMB （3，3′，5，5′四甲基联苯二胺）。表现出化学发光、紫外吸收以及颜色改变等信号的变化，具有优越的分析应用意义[15]。

本研究将具有不同功能特性的核酸序列组合到一起，发展了一种核酸酶催化放大比色传感平台，并用于Pb2+的比色检测。实验原理如图1所示，将富G核酸序列封闭于发夹结构探针中，当存在Pb2+时，发夹结构探针被切断，释放富G核酸序列，与Hemin结合形成DNA酶，引发显色反应。通过吸收信号的响应即可达到检测Pb2+的目的。

其中探针部分包含17E的底物链序列和构成催化DNA酶的富G序列。探针被设计为发夹结构，以实现对Pb2+的特异性显色。显色体系中所用的Pb2+DNA酶序列为经典的“817”脱氧核酶结构[11]，在Pb2+存在下显示出很高的催化切割活性。底物链是一个DNA与RNA嵌合体，剪切位点有一个腺嘌岭核酸核苷（rA），其余碱基全部为脱氧核糖核苷酸。当不存在Pb2+时，也就是DNA酶不切割的情况下，探针的‘Loopstem’发夹结构非常稳定，富G序列由于杂对被封闭，所以不能形成G四链体Hemin复合结构，即不能催化底物发生氧化还原显色反应。当存在Pb2+时，DNA酶切断了发夹结构探针的Loop部分，Loopstem发夹结构被破坏，只有几个碱基配对的双链茎部不能稳定存在，因此释放出富G序列与Hemin结合，形成具有很强过氧化物酶活性的DNA酶，催化ABTSH2O2发生显色反应，反应液的紫外吸收值的变化与Pb2+的浓度相关（图2）。从图2c可见，当不加入Pb2+时，体系仍有很高的吸收，说明17E会与发夹探针的Loop部分杂交，导致探针的Loopstem发夹结构不稳定或被破坏[16]，从而释放出富G序列与Hemin结合，形成G四链体复合结构，催化底物进行显色反应，增加检测体系的背景信号。所以，本实验加入Anti17E互补结合17E，以降低检测体系的背景信号。

3.2.2溶液pH值的影响在形成G四链体过程中，层间的G碱基之间是通过氢键的作用连接在一起的。由于 pH值影响氢键形成，实验中考察了溶液pH值对检测体系的影响。如图4所示，在溶液pH为6.0～7.0时，体系的紫外吸收变化不大。当溶液pH>7后，随着pH值升高，体系的信号响应逐渐降低。当pH=8.0时，本体系的紫外吸收变化几乎为零。所以在本实验体系中，溶液酸度选择为pH=7.0。

3.2.3酶切速率的考察在Pb2+存在下，底物被催化切割的速率加快[13]，从而释放出富G序列，形成G四链体结构。从图5可见，当反应时间达到30 min后，体系的紫外吸收变化达到稳定。表明在Pb2+存在下，酶催化底物的切割反应速率非常快；在没有酶和Pb2+的自发水解条件下，切割反应速率非常慢。为了保证酶催化切割反应的充分进行，且可忽略底物的自发水解对检测的影响，在Pb2+检测实验中反应时间选择30 min。