E―cad基因启动子甲基化在子宫内膜异位症中的异常表达*

【摘要】 目的：探讨E-cad基因启动子甲基化在子宫内膜异位症发生、发展中的作用。方法：随机选取于本院2013年1月-2015年1月行手术治疗的异位内膜病灶49例，其中45例术后病理诊断为子宫内膜异位症（卵巢）作为内异症组，对照组患者20例为同期住院因诊断性刮宫、行全宫切除术获取的子宫内膜组织。通过甲基化特异性PCR检测两组的E-cad启动子甲基化，比较各分期间甲基化表达的差异。结果：内异症组异位内膜中E-cad启动子甲基化26例，甲基化率为57.8%，对照组中E-cad启动子甲基化例数为0，两组比较差异有统计学意义（P

【关键词】 E-钙粘蛋白； 启动子甲基化； 子宫内膜异位症

子宫内膜异位症（内异症）所引起的痛经、下腹痛、痛、和不孕等，严重影响着育龄妇女的健康、生活质量和家庭稳定，近年来其发病率呈明显上升趋势，可达10%～15%，占普通妇科手术的30%以上[1-2]，从而日益受到人们的关注。笔者前期研究证实，作为重要的粘附分子的上皮型钙粘蛋白（E-cad）表达的降低或丧失在内异症发病中起着一定的作用[3]。近年研究发现，作为表观遗传学改变之一的DNA甲基化，其造成的相关基因异常表达在内异症发生发展中有着重要影响[4-6]。本研究采用甲基化特异性PCR（methylation specific polymerase chain reaction，MSP）检测E-cad基因启动子区甲基化情况，并比较其在内异症不同临床分期中的差异，探讨E-cad基因启动子甲基化在子宫内膜异位症发生、发展中的作用，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料 本研究随机抽取2013年1月-2015年1月于本院拟诊卵巢巧克力囊肿患者行手术治疗的异位内膜病灶49例，其中45例术后病理诊断为子宫内膜异位症（卵巢）。按照美国生育学会（AFS）修正子宫内膜异位症分期法，上述45例内异症组患者中13例为Ⅰ～Ⅱ期，17例为Ⅲ期，15例为Ⅳ期。对照组患者20例为同期住院因诊断性刮宫、行全宫切除术获取的子宫内膜组织，术后病理证实均为增殖期子宫内膜。半年内两组患者均未接受激素、化疗等药物治疗，无感染、肿瘤病史，无内、外科其他疾病史，半年内无妊娠及哺乳史，两组的年龄比较差异无统计学意义（P>0.05）。组织标本收集及研究方案已经过广州医科大学附属第二医院伦理委员会批准并与患者签署知情同意书。

1.2 方法 标本以蛋白酶K消化、酚/氯仿抽提法提取新鲜组织标本基因组DNA，紫外分光光度计检测0D260/OD280比值介于1.7～1.9。MSP方法检测上述组织中E-cad启动子甲基化状态，如DNA序列CG中C未发生甲基化，经亚硫酸盐修饰后，则CGUG，若已发生甲基化，则经亚硫酸盐修饰后CGCG。DNA原始甲基化情况不同，经处理后的DNA序列也有所不同。

1.3 判断标准 （1）甲基化阳性：甲基化特异性引物（MP）扩增出相应长度片段，但非甲基化特异性引物（UMP）不能扩增出相应长度片段；甲基化阴性：MP未能扩展出相应长度片段，UMP能够扩增出相应长度的片段；部分甲基化：UMP能够扩增出相应长度的片段，MP也能扩展出相应长度的片段，则判断部分细胞该基因启动子区5’CpG岛未甲基化。（2）MSP扩增结果判定标准：如果甲基化特异性引物（M）扩增出116 bpm条带，非甲基化特异性引物（U）未扩增出相应条带，标示E-cad基因启动子区CpG岛存在完全甲基化，反之则不存在甲基化。如M、U均扩增出相应大小的条带，则标示存在部分性甲基化（部分甲基化和完全甲基化在统计过程中均记为甲基化），见图1。

1.4 统计学处理 使用SPSS 17.0统计软件进行分析，计数资料采用 字2检验和Fisher确切概率法，以P

2 结果

2.1 E-cad基因启动子甲基化在内异症组与对照组的表达 内异症组中甲基化率为57.8%（甲基化和部分甲基化都归于甲基化组），对照组中甲基化率为0，内异症组与对照组比较，E-cad基因甲基化率差异有统计学意义（P

2.2 内异症组中各期E-cad基因启动子甲基化率的检测 内异症组Ⅰ～Ⅱ期甲基化率为23.1%，Ⅲ期甲基化率为58.8%，Ⅳ期甲基化率为86.7%。Ⅲ～Ⅳ期甲基化率与Ⅰ～Ⅱ期比较，差异均有统计学意义（P

3 讨论

3.1 E-cad基因启动子甲基化在内异症患者中异位内膜的异常表达 近年研究表明，肿瘤抑制基因的遗传变异（SNP）和启动子区甲基化可以使基因的表达改变或失活从而促进肿瘤的形成和进展[7-9]。其中DNA甲基化（DNA methylation）是最早发现的修饰途径之一，对基因组DNA进行可遗传性修饰，而不影响DNA碱基序列。研究表明，DNA甲基化可导致染色质结构、DNA构象、DNA稳定性和DNA与蛋白质之间相互作用方式的改变，从而控制基因表达。CPG岛是存在于基因组的含有丰富CPG位点的某些区域。研究表明，CPG岛为甲基化肿瘤中存在的普遍现象，且直接参与了细胞恶变过程[10-12]。国内外研究表明，肿瘤细胞的粘附下降是导致肿瘤发生、发展的重要原因之一。近年来随着对肿瘤发病机制的日益深入，发现在肿瘤侵袭、转移中粘附分子起着关键性作用，且E-cad启动子甲基化与肿瘤转移、侵袭之间存在着显著相关[13-16]。子宫内膜异位症是一种具有肿瘤生物学行为的良性疾病，有侵袭、转移、复发倾向，故推测断，E-cad启动子甲基化可能也与子宫内膜异位症的发生、发展相关[17-19]。

本研究中经甲基化特异性PCR方法检测的内异症组和对照组患者中E-cad基因启动子CpG岛甲基化状态，显示11例存在部分甲基化，也就是说既有甲基化特异引物的扩增，也有非甲基化特异引物的扩增。这一方面可能是由于混杂了炎性、正常或无CpG岛异常甲基化的细胞在上述组织细胞中，从而显示具有基因CpG岛异常甲基化的细胞，另一种可能是上述细胞中两个等位基因本身为半甲基化状态。

也有学者认为是由于部分组织可能有状态不稳定的表达水平较低的CpG岛异常甲基化[11]，可能CpG岛的甲基化是个渐进化的过程，也就是说，每一个CpG岛上存在的胞嘧啶碱基是逐渐被甲基化的。其他学者认为只有CpG岛甲基化率超过60%时才能够完全关闭相应的基因表达，而低比率的甲基化只能降低基因的转录表达而不能关闭其表达。由此可见，无论E-cad基因启动子CpG岛是完全还是部分甲基化，CpG岛的逐渐异常甲基化状态可能会导致基因的转录表达逐渐减低，从而导致基因蛋白表达逐渐减少、甚至最后完全消失。亦有研究显示基因转录抑制与CpG岛基因甲基化直接相关，也就是说启动子CpG岛发生了甲基化，而使基因无法转录，从而抑制了基因的表达，其功能也随之丧失[10]。

本试验中，45例内异症组中存在26例甲基化，甲基化率为57.8%；20例对照组中0例甲基化，甲基化率为0，内异症组中存在E-cad基因启动子高度甲基化，而对照组织中未检测到甲基化状态。E-cad基因甲基化表达率内异症组明显高于对照组，比较差异有统计学意义（P

3.2 内异症组不同临床分期E-cad基因启动子甲基化率 有研究显示，同一患者正常位置的子宫内膜和异位内膜的E-cad mRNA转录水平是有差异的，异位内膜水平较在位内膜水平高[20-21]。E-cad在子宫内膜异位症患者在位内膜轻度下降，异位内膜显著下降，且与子宫内膜异位症临床分期相关。Wu等[13]的研究也表明，随着内异症病情的进展，E-cad基因启动子甲基化率有上升趋势，其E-cad蛋白表达有下降趋势。由此推测，E-cad基因启动子CpG岛的异常甲基化可能在内异症发病中起着重要作用。

笔者研究发现，内异症组中各期的E-cad启动子甲基化率不同，Ⅰ～Ⅱ期甲基化率为23.1%，Ⅲ期甲基化率为58.8%，Ⅳ期甲基化率为86.7%。Ⅲ～Ⅳ期甲基化率与Ⅰ～Ⅱ期比较，差异均有统计学意义（P

综上所述，本研究显示在子宫内膜异位症患者的异位病灶中存在着E-cad基因启动子甲基化，且甲基化率随临床期别增加而增加，提示E-cad基因启动子甲基化在子宫内膜异位症发生、发展中可能起到一定的作用。今后应在增大样本量基础上，深入研究同一个体异位内膜和在位内膜的甲基化表达情况，有望进一步探讨甲基化酶抑制剂对异位病灶中E-cad基因启动子可能的去甲基化作用，从而为阻遏异位病灶的增殖作用的研究提供新思路。

参考文献

[1]黄倩，程明军，俞而慨，等.尼古丁对子宫内膜异位症患者腹腔巨噬细胞TNF和IL-8分泌的影响[J].现代妇科进展，2007，16（5）：345-350.

[2]郎景和.子宫内膜异位症研究的理论和实践、发病、诊断和治疗的“三化”[J].中华妇产科杂志，2011，46（11）：529-567.

[3]史文静，宋绿茵，梅开勇，等.子宫内膜异位症异位及在位内膜中E-cad表达水平的研究[J].广州医药，2007，38（4）：16-19.

[4] Houshdaran S，Nezhat C R，Vo K C，et al.Aberrant endometrial DNA methylome and associated gene expression in endometriosis[J].Biol Reprod，2016，95（17）：116.

[5] Dyson M T，Roqueiro D，Monsivais D，et al.Genome-Wide DNA Methylation Analysis Predicts an Epigenetic Switch for GATA Factor Expression in Endometriosis[J].PLoS Genet，2014，10（3）：e1004158

[6] Zhang R L，Peng L X，et al.IL-8 suppresses E-cadherin expression in nasopharyngeal carcinoma cells by enhancing E-cadherin promoter DNA methylation[J].Oncol，2016，48（1）：207-214.

[7] Tomlimon I P，Roylanee R，Houlston R S.Two hits revisited again[J].Med Genet，2001，38（2）：81-85.

[8] Esteller M.CPG island hypermethylation and tumor suppressor genes：a booming Present. a brighter fortune[J].ON cogene，2002，21（35）：5427-5440.

[9] Rashid H，Alam K，Afroze D， et al.Hypermethylation status of E-cadherin gene in gastric cancer patients in a high incidence area[J].Asian Pac J Cancer Prev，2016，17（6）：2757-2760.

[10] Fan X，Inda M M，Tumon T，et al.Improvement of the methylation specific PCR technical conditions for the detection of p16 prometer hypermethylation in small amounts of tumor[J].Oncol Rep，2002，9（1）：181-183.

[11] Gonzalgo M L，Hayashiba T，Bender C M.The role of DNA methylation in exprssion of P19/P16 locus in human bladder cancer cell line[J].Caner Res，1998，58（6）：1245-1252.

[12] Nasu K，Kawano Y，Tsukamoto Y，et al.A berrant DNA methylation status of endometriosis：epigenetics as the pathogenesis，biomarker and the rapeutic target[J]. Obstet Gynaecol Res，2011，37（7）：683-695.

[13] Wu Y，Strawn E，Basir Z，et al.A berrant expression of deoxyribonucleic acid methyltransferases DNMT1，DNMT3A and DNMT3B in women with endometriosis[J].Fertil Steril，2007，87（1）：24-32.

[14] Kwan R，Looi K，Omary M B.Absence of keratins 8 and 18 in rodent epithelial cell lines associates with keratin gene mutation and DNA methylation：cell line selective effects on cell invasion[J].Exp Cell Res，2015，335（1）：12-22.

[15]郭久柏，张琦.β-连环素与E-钙粘素在子宫异位内膜、子宫内膜癌和正常子宫内膜中的表达对比研究[J].中国医学创新，2010，7（7）：10-12.

[16] Nasu K，Kawano Y，Kai K，et al.Aberrant histone modification in endometriosis[J].Front Biosci （Landmark Ed），2014，19（1）：1202-1214.

[17] Saliminejad K，Edalatkhah H，Kamali K，et al.Association of common variations of the E-cadherin with endometriosis[J].Gynecol Endocrinol，2015，31（11）：899-902.

[18]单莉莉，岳瑛，肖天慧.子宫内膜异位症与hMLH1启动子的甲基化[J].实用妇产科杂志，2010，26（6）：444-446.

[19]杨娟，方小玲.DNMT1、DNMT3a及DNMT3b 在子宫内膜异位症中的表达[J].中南大学学报（医学版），2012，37（1）：94-99.

[20]田艳芹.E-cad、VE-cad在子宫内膜异位症发生及发展中的意义[J].中国实用医药，2015，10（30）：18-20.

[21] Shaco-Levy R，Sharabi S，Benharroch D，et al.Matrix metalloproteinases 2 and 9 E-cad，and beta-eatenin expression in endometriosis，low-grade endometrial carcinoma and non-neoplastic eutopic endometrium[J].Eur J Obstet Gynecol Reprod Biol，2008，139（2）：226-232.

（收稿日期：2016-06-01） （本文编辑：周亚杰）