胰岛素对大鼠肝细胞损伤的保护作用

【摘要】目的：探讨胰岛素对大鼠肝细胞损伤是否具有保护作用。方法：胶原酶原位灌流分离大鼠肝细胞并原代培养，分别用脂多糖（LPS）及胰岛素处理肝细胞，12 h后检测肝细胞损伤及存活率。结果：LPS可引起肝细胞损伤，使丙氨酸氨基转移酶（ALT）和天门冬氨酸氨基转移酶（AST）增高；胰岛素可减轻上述肝细胞损伤（ALT活性降低55.5%、AST活性降低24.4%，P

【关键词】胰岛素；肝细胞；脂多糖

文章编号：1009-5519（2008）12-1739-02 中图分类号：R36 文献标识码：A

严重创伤、全身感染、肝病以及众多的危重疾病在其发生发展过程中都可发生内毒素血症，同时产生的内毒素可进一步加剧肝脏病变，导致肝功能衰竭，引起不可逆损伤，死亡率增加。临床研究发现，对于重症监护患者胰岛素的强化治疗可降低死亡率及其合并症的发生率[1，2]，但其治疗作用的机制目前尚不清楚。随着对胰岛素研究的深入，其新的作用机制揭示，胰岛素除调节细胞糖代谢外，还可通过磷酸化机制激活和调节“细胞生存信号（survival signaling）”系统，直接促进多种组织细胞的修复和生存[3]。因此，胰岛素对细胞的保护作用日益受到人们的重视。本实验以脂多糖（LPS）诱导的大鼠肝细胞损伤为模型，观察胰岛素对大鼠肝细胞损伤的直接保护作用。

1 材料和方法

1.1 材料：Spragure-Dawley大鼠，雄性，重量200~250 g，购自第四军医大学实验动物中心。DMEM培养液和小牛血清为Gibco公司产品，胰蛋白酶、胰岛素和LPS为Sigma公司产品，Ⅳ型胶原酶为Worthington Biochemical公司的产品。MTT为Amresco公司产品，丙氨酸氨基转移酶（ALT）和天门冬氨酸氨基转移酶（AST）检测试剂盒购自北京中生公司。

1.2 方法：肝细胞的分离与原代培养：采用改良的Seglen方法。250 ml/L乌拉坦 (5 ml/kg) 腹腔注射麻醉大鼠，酒精浸泡消毒，在超净台上打开腹腔，门静脉插管，连接蠕动泵，原位灌注含有1 000 IU肝素的D-Hanks液，剪开下腔静脉，灌注约10 min停止，继续灌注2.5 ml/LⅣ型胶原酶10 min，待肝脏变为土黄色时，停止灌注。小心分离肝脏，置平皿中，钝性撕碎肝脏，移入50 ml广口瓶中，再加入10 ml胶原酶摇晃消化肝组织20 min，加入20 ml含100 ml/L小牛血清的DMEM培养液终止消化，200目筛网过滤，滤液离心，经500 g离心5 min，弃上清，DMEM培养液离心洗涤3次。最后重悬于含200 ml/L小牛血清的DMEM培养液 (内含105 U/L青霉素和100 mg/L链霉素) 中，用台盼蓝排除法检测细胞存活率，活细胞数>95%方可用于实验。调整细胞密度为2.0×105/L，接种于24孔(每孔1 ml) 及96孔 (每孔0.1 ml)培养板内，37 ℃、50 ml/L CO2的细胞培养箱中培养24 h后换液。

1.2.1 实验分组:取原代培养24 h的肝细胞分为5组，分别用以下培养液：(1)Normal：无血清DMEM培养液；(2)LPS：含20 μg/L LPS的无血清 DMEM培养液；(3)LPS＋10-9 Insulin：含10-9 mol/L胰岛素和20 μg/L LPS的无血清DMEM培养液；(4)LPS＋10-8 Insulin：含10-8 mol/L胰岛素和20 μg/L LPS的无血清DMEM培养液；(5)LPS＋10-7 Insulin：含10-7 mol/L胰岛素和20 μg/L LPS的无血清DMEM培养液，每组重复数为8，作用12 h后，收集24孔板中细胞培养上清液，并消化细胞。

1.2.2 MTT检测：在培养肝细胞的96孔培养板中每孔加入5 g/L MTT液20 μl，继续培养4 h，弃上清，加入二甲基亚砜150 μl，震荡10 min，用酶标仪于492 nm波长处测定吸光度值。细胞存活率=[(试验组吸光度值－空白对照组吸光度值)/对照组吸光度值]×100%。

1.2.3 ALT和AST测定：采用比色法用自动生化分析仪分别测定各组肝细胞培养上清液中的ALT和AST活性，具体步骤按照试剂盒说明书进行。

1.2.4 统计学处理：实验数据均以x±s表示，采用 GraphPad Prism 4.0 统计程序进行统计学分析。多组间数据比较采用单因素方差分析 (ANOVA)，若总体差异显著，再以Bonferroni t检验分析相应两组间显著性差别。以P

2 结果

2.1 胰岛素对肝细胞存活率的影响：MTT结果显示(见图1)：与正常肝细胞组相比，LPS 导致肝细胞损伤，引起肝细胞存活率的显著下降(P

2.2 胰岛素对肝细胞酶学的影响：测定不同处理组的肝细胞培养上清液中ALT、AST的活性。与MTT检测结果一致，LPS引起肝细胞ALT、AST释放增加(均P

3 讨论

烧伤、脓毒血症、感染性休克等多种危重疾病及肝脏疾病的患者多伴有肠源性内毒素血症，而内毒素是触发肝功能衰竭综合征的重要物质基础，在体内可直接或通过激活枯氏细胞释放化学介质引起肝细胞凋亡或坏死，进一步加重肝组织损伤，导致肝功能衰竭。本研究采用LPS直接作用于原代培样的大鼠肝细胞，诱导细胞损伤；并在此肝细胞损伤模型上发现胰岛素可促进肝细胞生存率，降低ALT和AST酶学活性，减轻肝细胞损伤。

由于受到体内多种因素的影响，有关内毒素对肝细胞的直接作用不易阐明。近年来在培养肝细胞中进行内毒素毒性作用的研究逐渐增多，有研究发现内毒素单独作用于肝细胞明显引起肝细胞损伤，可引起体外肝细胞形态及功能变化，如肝细胞中的圆形细胞增多且黏附功能消失，同时己糖摄取减少，肝细胞3H-亮氨酸整合降低，细胞色素P450水平降低等。本实验给予大鼠肝细胞LPS处理，结果显示LPS可诱导肝细胞损伤，引起肝细胞存活率下降，细胞上清液中ALT和AST活性增高。

参考文献：

[1] Van den Berghe G，Wouters P，Weekers F，et al. Intensiveinsulin therapy in critically ill patients[J].N Engl J Med，2001，345:1359.

[2] Das UN. Insulin and Inflammation: further evidence and discussion[J].Nutrition，2002，18：526.

[3] Lawlor MA，Alessi DR.PKB/Akt：a key mediator of cell proliferation survival and insulin responses?[J].J Cell Sci，2001，114:2903.

收稿日期：2008-02-29