CIK\DC-CIK细胞抗鼻咽癌CNE2细胞的作用研究

【中图分类号】R739 【文献标识码】A 【文章编号】1672－3783(2011)11－0034－01

【摘要】目的：探讨CIK、DC-CIK细胞在抗鼻咽癌CNE2细胞中的作用。方法：采用3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐法对经过体外诱导、扩增的CIK和体外培养的DC-CIK对鼻咽癌CNE2细胞杀伤活性进行检测。结果：在滴度 1:10以上时DC-CIK细胞对鼻咽癌CNE2细胞杀伤活性明显比CIK细胞高（P＜0.05）。结论：在抗鼻咽癌CNE2细胞的作用方面DC-CIK比单纯CIK细胞显著增高。

【关键词】CIK细胞；DC-CIK细胞；鼻咽癌CNE2细胞

鼻咽癌作为多基因遗传疾病，其发病诱因很多，包括饮食习惯、环境因素、人类疱疹病毒感染、遗传因素等多种因素，其具体的发病机制目前还不清楚，但近年相关研究显示，鼻咽癌的生物学行为、产生、发展与鼻咽癌细胞的凋亡和增殖失调有关，因此，对肿瘤细胞增殖的抑制和其凋亡的促进是防治鼻咽癌的关键。CIK细胞作为细胞因子诱导杀手细胞，是具有杀菌活性高、体外繁殖能力强的光谱抗瘤免疫细胞，DC-CIK细胞是CIK细胞和目前抗原递呈细胞中已知功能最强的DC细胞共同培养物，为探讨DC-CIK、CIK细胞在抗鼻咽癌CNE2细胞的作用，采用3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐法其伤活性进行了检测。

1 资料和方法

1.1 研究试剂: 培养基选用TaKaRa生物技术有限公司的GT-T551无血清培养基，试剂盒选用Promega公司的Cyto Tox96细胞毒试验试剂盒，用R&D公司的CD3McAb、rhIL-2、rhlL-1、rh TNF-a、rhIFN-y、rhGM-CSF进行培养，采用CD3、CDl4、CD3CD4、CD3CD56、CD3CD8、鼠抗人CDla、FITC兔抗鼠荧光二抗和HLA―DR等流式细胞仪标记抗体。

1.2 细胞培养和诱导方法

1.2.1 体外诱导、扩增CIK细胞的方法: 采集在健康体检部门进行体检的健康人群的30ml外周血，采用淋巴细胞分离液将PBMNC从血样例分离出来后，用GT-T551无血清培养液将细胞浓度调至4×106/ml至6×106/ml水平并放入5%二氧化碳培养箱，将培养箱调至37℃进行2h的培养，将非贴壁细胞收集后，用IMDM（含10%人AB血清）将细胞浓度调至1×106/ml至2×106/ml水平，然后加入IFN-a1000U/ml进行悬浮培养24小时，再将1000U/ml rh1l-2和CD3单克隆抗体1ug/ml加入其内，并半量换液，3天半/次，换液后行rh1l-2的补充，使细胞浓度一直保持在1×106/ml至2×106/ml水平。

1.2.2 体外培养DC方法:将血样中分离并培养了2小时的PBMNC中的提笔细胞收集，并将其加入含有1000U/ml IL-4和GM-CSF的GT-T551无血清培养液，同样，放入5%二氧化碳培养箱并将温度设至37℃培养，行换液1次/3d并及时补充rh1l-2细胞因子，第二次换液时，将CNE2细胞冻融液加入，然后在培养一天。

1.2.3 DC-CIK细胞培养方法: 将以上培养获取的DC合CIK细胞计数并按照1:5的比例进行混合培养3天。

1.3 检测方法:严格按照Cyto Tox96细胞毒试验试剂盒的操作规程实施试验操作，采用3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐法，检测CIK和DC-CIK的对鼻咽癌CNE2细胞杀伤活性。

1.4 统计方法: 采用统计软件SPSS11.0进行统计分析，数据用t检验并用标准均数差（x+s）表示，P＜0.05时表示存在显著性差异。

2 结果

在滴度 1:10以上时DC-CIK细胞对鼻咽癌CNE2细胞杀伤活性明显比CIK细胞高（P＜0.05），CIK和DC-CIK的滴度越高，其杀伤活性越强，详见表1。

3 讨论

鼻咽癌是多基因遗传恶性肿瘤，引起其发病的原因很多，很难进行有效的预防，且大部分属于恶性程度较高的未分化、低分化癌，因此一旦患病，治疗难度大。目前临床治疗的主要手段是放射治疗，但相关研究显示鼻咽癌的单纯放射治疗仅有50%的5年生存率，鼻咽癌晚期患者治疗的5年生存率仅10%到40%，主要原因在于鼻咽癌细胞的远处转移和局部复发［1］，以及长期的放射治疗对患者身体造成严重损伤机体修复能力和承受能力降低。

CIK作为抗肿瘤效应细胞，是主要来源于人类外周血、脐带血的单核细胞在体外经多种细胞因子诱导而产生并大量增殖的异质细胞，其可以有效避免对患者机体免疫系统功能和结构的损伤，并将鼻咽癌肿瘤细胞直接杀死，相关研究证明［2-3］其在多种实体肿瘤手术及放化疗等治疗方式的辅助免疫治疗方面具有良好的效果，并可以使肿瘤患者的症状和生活质量等方面得到有效改善。DC细胞是目前效果最强的专职抗原提呈细胞，其可以通过一定途径将肿瘤抗原提呈，使肿瘤细胞存在的免疫逃避得以抑制。相关研究显示［4-6］，经CIK经DC刺激后，其细胞毒活性增强显著，有关体外实验结果表示［7］在杀伤多种肿瘤细胞方面结合了CIK的高效杀瘤活性和DC强大的抗原提呈能力的DC-CIK细胞的效果比同条件下的CIK细胞明显，本研究结果显示在滴度 1:10以上时DC-CIK细胞对鼻咽癌CNE2细胞杀伤活性明显比CIK细胞高（P＜0.05），且CIK和DC-CIK的滴度越高，其杀伤活性越强，证明在抗鼻咽癌CNE2细胞的作用方面DC-CIK比单纯CIK细胞显著增高。

参考文献

［1］ 张力．鼻咽癌治疗的新进展［J］．临床肿瘤学杂志，2008．13(3)：193-196．

［2］ 江浩，刘开彦，童春容，等．化疗联合自体细胞因子诱导杀伤细胞治疗急性白血病的临床观察［J］．中华内科杂志，2005，44(3)：198-201．

［3］ 施明，王福生，张冰。等．自体CIK细胞治疗肝癌的安全性和有效性评价［J］．医学杂志，2004，2(4)：333-335．

［4］ 周昌菊，马薇，周建大，等．自体宫颈癌一树突细胞疫苗激活的CTL杀伤效应［J］．癌症杂志，2006．25(2)：143-147．

［5］ Hackstein H，Thomson AW．Dendritic cells：emerging phannacological targets of immunosuppressive drugs［J］．Nat Rev Immunol．2004．4(1)：24-34．

［6］ Yamaguchi Y，Ohshita A．Kawabuehi Y，et a1．Adoptive immunotherapy of cancer using activated autologous lymphecytes-current status and new strategies［J］．Hum Cell，2003．16(4)：183-189．

［7］ Marten A，Ziske C，Sehottker B，et a1．Interactions between dendritic ceils and eytokine-induced killer cells lead to an activation of bothpopulations［J］．J Immunother，2010.24：502-510．

作者单位：200010 黄浦区中西结合医院

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