桃核承气改良方对家兔血管内皮损伤后PDGF-B和VEGF影响的实验研究

摘 要:目的:研究中药桃核承气改良方对家兔血管内皮损伤后pdgf-b(血小板源生长因子B蛋白)和vegf(血管内皮生长因子)的影响。方法:健康新西兰大耳白兔40只,体重2~2.5kg。将动物分模型组(n=10)、中药组(n=10)、西药组(n=10)、空白组(n=10),模型组、中药组、西药组高酯饲料喂养4周后行腹主动脉内膜剥脱术造模。术后模型组、中药组、西药组正常饲料喂养,中药组予桃核承气改良方灌胃4周,西药组予舒降之、阿司匹林灌胃4周,模型组、对照组予生理盐水灌胃4周。造模术4周后处死家兔,用免疫组化法观察各组对血小板源性生长因子(PDGF-B)表达的影响;采用半定量RT-PCR法测定血管中VEGF mRNA半定量,采用Western Blot(免疫印迹)印迹杂交法结果量化分析。结果:与模型组比较,中药组内膜/中膜厚度比、内膜/中膜面积比显著减少( P < 0. 05) ;中药组使血管壁PDGF-B 含量下降;模型组VEGF mRNA半定量、蛋白表达较对照组明显升高(P

关键词:桃核承气改良方;血管内皮;PDGF-B;VEGF

中图分类号:R285.5 文献标识码:A 文章编号:1673-7717(2010)01-0100-04

Experimental Study of Taohe Chengqi on Vascular Endothelial Injury in Rabbit after PDGF-B and VEGF Affected

WANG Jian, GONG Lihong

(Affiliated Hospital of Liaoning University of TCM, Shenyang 110032, Liaoning, China)

Abstract:Objective:To study the improvement of Chinese medicine Taohe Chengqi on vascular endothelial injury in rabbits after PDGF-B (platelet-derived growth factor B protein) and VEGF (vascular endothelial growth factor) affected. Methods: New Zealand 40 rabbits, weighing 2～2.5kg. Animals divided into model group (n=10), traditional Chinese medicine group (n=10), chemical medicine group (n=10), the control group (n=10), model group, the Chinese Medicines Board, chemical medicine group fed the high-ester 4 weeks after abdominal aortic endarterectomy model. After the model group, the Chinese Medicines Board, chemical drugs and normal diet group, the Chinese Medicines Board to improve the side Taohe Chengqi gavage for 4 weeks, the chemical group to the drug Zocor, aspirin orally for 4 weeks, model group, control group to the saline gavage for 4 weeks. Surgery model in rabbits were sacrificed after 4 weeks from the abdominal aorta artery pathological changes observed, measured intima, media thickness and area, by immunohistochemical method to observe the group of platelet-derived growth factor (PDGF-B) expression impact; using semi-quantitative RT-PCR determination of VEGF mRNA in blood vessels semi-quantitative, using Western Blot (immunoblot) blot hybridization results of quantitative analysis. Results: Compared with model group, the Chinese Medicines Board intima / media thickness ratio and intima / media area ratio significantly reduced (P

Key words:Taohe Chengqi improved side; vascular endothelial; PDGF-B; VEGF

冠脉再狭窄是一种医源性疾病,在临床中屡见不鲜,而PCI术后再狭窄的机制主要为血栓形成、炎症反应、血管平滑肌增殖、细胞外基质及胶原纤维过量增生、血管重塑等。PDGF通过一系列复杂的作用网络,最终形成动脉粥样硬化特征性斑块,导致再狭窄的发生;而VEGF通过一系列复杂的作用网络,最终促使新毛细血管生成和其功能成熟。有鉴于此,本文旨在探讨核承气桃改良方对PDGF、VEGF的影响,从而预防冠心病经皮冠状动脉介入治疗技术术后冠脉再狭窄。

1 材料与方法

1.1 实验材料

动物及饲料:健康新西兰大耳白兔40只,体重2～2.5kg,由辽宁中医药大学实验动物中心提供。家兔普通饲料、家兔高脂饲料(基础饲料79%、15%蛋黄粉、猪油5%、胆固醇1%)均由辽宁中医药大学动物实验中心加工。

主要试剂及仪器:PDGF-B 抗体, SA1020 免疫组化染色试剂盒,均由武汉博士德生物公司提供,SN～695型智能放免r测量仪,上海原子核研究所日环仪器一厂生产。SANYO MDF～382E超低温冰箱(日本三洋公司)恒温水浴箱、SmartView2001生物电泳图像分析软件鼠抗人单克隆抗体COX―2(GT201202),购自Gene公司,封闭用正常山羊血清工作液,总RNA提取试剂异硫氰酸胍(美国Invitrogen Life technologies公司),反转录酶(AMV), RNA酶抑制剂,dNTP混合液,Oligo(dT)15,Taq DNA聚合酶,目的基因引物(日本TaKaRa公司)考马斯亮蓝蛋白定量试剂盒(南京建成生物工程公司)碱性磷酸酶标记的羊抗鼠IgG(北京中山生物技术有限公司)PCR扩增仪(德国Biometra), Chemi Imager5500凝胶电泳成像分析系统(美国Alphainnotech chemi Imager)。

1.2 实验方法 实验分组及药物制备:实验分组:健康新西兰大耳白兔40只,将动物随机分模型组、中药组、西药组、空白组,每组10只;桃核承气改良方(大黄30g,芒硝15g,甘草15g,肉桂15g,桃仁15g,水蛭25g,金银花20g),由辽宁中医药大学附属第一医院提供。药物用水浸泡0.5h,先武火再文火煎1h,倒出药汁,共煎3次,将药汁合并,过滤,浓缩至100mL(相当于生药1.35g/mL),4℃冰箱保存。舒降支40mg/片,批号:由杭州默沙东制药有限公司提供。阿司匹林100mg/片,由拜尔药业集团有限公司提供。研磨后,双蒸水溶解,4℃冰箱保存。

动物造模:动物造模:除空白组外的3组动物高酯饲料喂养4周造成动脉粥样硬化模型[2],然后行腹主动脉内膜剥脱术造模:25%乌拉坦腹腔注射0.4mL/100g麻醉家兔,于右侧腹股沟部进行脱毛消毒后利多卡因少量局麻,切皮拨肉分离股动脉,两动脉夹分别夹住股动脉近心远心端暴露2cm左右,剪开动脉周长三分之一口,用6F穿刺针刺破动脉壁,经导丝导入直径1.5~2.0mm球囊导管(依血管直径大小而定),至肾动脉下方,盐水充盈球囊(压力为4~6kPa),缓慢回拉导管至切口处抽空球囊内液体,使压力降至零,重复上述过程3次,达到剥落腹主动脉内皮的目的。撤出导管,结扎股动脉,缝合皮肤,术后3天每天连续肌注青霉素80万U/只,预防感染。

实验取材:术后4周处死家兔,切开腹壁暴露腹腔,将肠管翻至一侧,分离腹主动脉,截取2cm长腹主动脉用生理盐水冲洗后放于10%的中性甲醛溶液中-20℃贮存。

1.3 指标测定 ①PDGF-B半定量RT-PCR:取实验兔的血管内皮组织200mg。测定mRNA;参照说明。引物COX-2和β-actin内参对照引物由中国医科大实验室提供。参照RT-PCR试剂盒说明书合成cDNA。参照RT-PCR试剂盒说明书进行PCR反应。取 5μL PCR产物与2μL上样缓冲液混合,进行 1.5%琼脂糖凝胶电泳 (120V, 45min),电泳结束后,凝胶成像仪成像分析。中药对动脉壁PDGF-B含量影响[2]取腹主总动脉,制成石蜡切片,3 % H2O2灭活内源性酶10min ,加复合酶消化液置8min ,滴加正常山羊血清封闭液置20min ,加PDGF-B 链单克隆抗体,4℃过夜,次日加生物素化山羊抗鼠/ 兔IgG,37℃反应40 min ,滴加试剂SABC ,37℃反应30 min ,显色,脱水,中性树胶封固。新生内膜部位棕黄色颗粒为PDGF-B 染色阳性信号。在400倍光镜下,随机选取5 个视野,按染色颗粒多少及染色强度进行半定量分组定分: Ⅰ组(分值1分),所有视野未见阳性表达颗粒; Ⅱ组(分值2分),3～4个视野有少数阳性表达颗粒; Ⅲ组(分值3分),3～4 个视野有较多阳性表达颗粒,1～2 个视野则少数; Ⅳ(分值4分),所有视野均有较多阳性表达颗粒,2 个以上视野有较多强阳性表达颗粒。

②Western Blot印迹分析VEGF蛋白表达:参考试剂盒说明。

1.4 数据处理采用SPSS 10.0软件统计学处理,数据以平均值±标准差(±s)表示,计量资料组间用ANOVA,两组间比较用q检验,计数资料率用χ2检验,P

2 结 果

2.1 PDGF-B免疫组化结果见图1。

免疫组化染色图象分析结果:阳性颗粒主要表达部位在腹主动脉内膜内皮细胞胞浆,动脉中膜及内皮下的平滑肌细胞胞浆有少量表达。空白组内膜很薄,在腔面只见一层内皮细胞核,内弹性膜呈波浪状,与中膜分界明显;模型组内膜增生严重,内弹力板不连续,内膜增厚处向腔内呈丘状或扁平状隆起,大量平滑肌细胞排列紊乱和大量泡沫细胞积聚;中药组、西药组与模型组比较内皮连续、增生减低。说明桃核承气改良方能使兔腹主动脉内膜损伤后内膜增生减低 。

2.2 兔腹主动脉内膜剥脱术后28天各组动脉壁PDGF-B 含量 见表1。

结果显示,模型组血管壁PDGF-B 含量明显增加。中药组和西药组均使血管壁PDGF-B 含量下降,中药组和西药组无显著差异。

2.3 家兔血管内皮中VEGF的mRNA半定量RT-PCR结果 见图2。在不同试验组兔子血管内皮中,均可见到VEGF的mRNA表达。其中,模型组中VEGF的mRNA表达上调;中药组,化学药组VEGF的mRNA表达被抑制。Western Blot结果量化分析,见图3。采用FlourChem V2.0凝胶成像分析软件(America)分析,记每条蛋白电泳带的灰度值,进行定量分析。结果表明STAT3和VEGF的蛋白表达明显减少,和对照组比较差异具有统计学意义。

3 讨 论

冠脉再狭窄是一种医源性疾病,通常在PCI术后3~6个月发生,单纯球囊扩张后发生率30%~50%[1];冠脉金属裸支架置入术后10%~40%的患者可发生支架内再狭窄[2];药物洗脱支架如雷帕霉素洗脱支架的再狭窄发生率仍有5%~10%[3]。研究表明,PCI术后再狭窄的机制主要为:血栓形成、炎症反应、血管平滑肌增殖、细胞外基质及胶原纤维过量增生、血管重塑等。

Danenberg证实在新生内膜内,巨噬细胞显著增多并且表达多种生长因子,细胞因子和酶参与新生膜的形成[4]。当球囊损伤血管壁的早期,由于内皮细胞受损,基底膜暴露,胶原纤维粘连等和促凝血物质释放入血液,同时多种细胞因子生长因子和趋化因子分泌增加,从而促进了炎细胞侵入和有害物质的透入,诱发局部病毒感染,进而启动和引起一系列血管损伤和修复反应,引起大量的血小板聚集、黏附、释放。其中大量的PDGF 促使单核巨噬细胞、平滑肌细胞向内膜下迁移、增生,同时产生多种细胞因子和生长因子,再通过自分泌和旁分泌的作用,形成复杂的作用网络,导致局部细胞脂质代谢异常,泡沫细胞形成和细胞基质过量产生,形成动脉粥样硬化特征性斑块,导致再狭窄的发生。PDGF或其受体的特异性阻滞剂能够抑制内膜的增生。

血管内皮生长因子(VEGF)是一簇结构上具有同源性并富含半胱氨酸的糖蛋白。VEGF的生物特性:与成纤维细胞生长因子、肝细胞生长因子、粒细胞集落刺激因子、胎盘生长因子、血小板生长因子等促生长因子相比, VEGF是最具有选择性作用的生长因子[5],它是特异的血管内皮细胞促有丝分裂原,并不广泛作用于其他组织细胞,而且VEGF同时具有增加血管通透性的作用,又被称为血管通透因子。心肌细胞、内皮细胞、平滑肌细胞均可分泌VEGF,VEGF通过与其特异受体结合而发挥作用,在人的冠状动脉内皮细胞和心肌细胞中VEGFr21 和VEGFr22 < flk21 /KDR均高表达,这提示VEGF的功能主要以旁分泌和自分泌的形式实现。研究表明,VEGF可促使血管内皮细胞增殖,分化成熟,抑制血管内皮细胞的凋亡,诱导血管平滑肌细胞的迁移,并促进血管平滑肌细胞合成和分泌基质金属蛋白酶,并加速基质降解以及趋化炎症细胞等,并加速基质降解以及趋化炎症细胞等,最终促使新毛细血管生成和其功能成熟[6]。

桃核承气改良方是由大黄、芒硝、甘草、肉桂、桃仁、水蛭、金银花组成。大黄破瘀泻热,芒硝泻热软坚,助大黄下瘀泻热并为君药,桃仁为活血祛瘀之药,与大黄配伍,瘀热并治,水蛭为破血逐瘀之药,金银花芳香疏散,清热解毒共为臣药,肉桂辛散温通,通行气血经脉为佐药,炙甘草入心经,护胃安中,缓诸药峻烈之性,以为使药。该方具有活血化瘀,通下瘀毒兼扶正气之功效,使蓄血去,瘀毒清,诸证平。现代药理研究证明:大黄素抑可以制正常动脉的粥样硬化及培养球囊扩张模型的兔离体SMC 增殖;大黄能显著提高脑缺血再灌注血清中NO 的水平,推测大黄能通过调节NO 的水平保护血管内皮细胞[7]。桃核承气汤药味配伍促进了大黄酸的吸收利用,抑制动物血栓形成和血小板聚集[8],桃仁抗血小板聚集作用,抗氧化作用[9]。水蛭素是水蛭唾液的提取物之一,是凝血酶的特异性抑制剂,朱智明等应用120I标记血小板观察了水蛭素对模拟血管成形术后血小板积量的影响,结果表明水蛭素组损伤段血小板沉积量与对照组损伤段相比减少了43%[10],张涛等利用家兔实验性动脉粥样硬化狭窄模型并进行PTCA术后,饲入水蛭粉,血管造影发现水蛭组动脉内膜VSMC分化较好,细胞内粗面内质网较少,肌丝较多,而对照组VSMC合成型多见含有较多的粗面内质网。提示水蛭有抑制PTCA术后VSMC增生,减轻内膜增生,降低再狭窄率的作用[11]。肉桂和肉桂醛对氧自由基诱导的自发性高血压大鼠离体主动脉收缩有抑制作用,金银花有抑菌,抗炎抗病毒的作用。

本实验表明,核承气桃改良方的通下瘀毒,扶助正气之功效使炎细胞和有害物质不易透入,抑制血小板聚集、黏附及血管平滑肌细胞增殖,使PDGF的分泌减少,内膜增生减低,明显抑制管腔狭窄,能下调VEGF含量,诱导一氧化氮合酶的合成提高一氧化氮量,抑制血管内皮增生,促进损伤内膜修复,为中医药防治PCI术后的再狭窄提供了有利有理的实验依据。

参考文献

[1] Bauters C,Meurice T,Hamon M,et al.Mechanisms and preven-tion of restenosis: from experimental models to clinical practice[J].Cardiovasc Res,1996,31(6):835-846.

[2] Rensing BJ, Vos J, Smits PC, et al. Coronary restenosis elimina-tion with a sirolimus eluting stent: first European human experience with 6-month angiographic and intravascular ultrasonic follow-up[J].Eur Heart J,2001,22(22)2125-2130.

[3] Mosea JW, O'Shaughnessy C,Capito R,et al.The US multicenter, randomized,double blind study of the sirolimuseluting stent in coronary lesions: safety out comes at 9 months[J].Eur Heart J,2002,23(Suppl):264.

[4] Hiroyuki Hao, GiulioGabbiani,Marie-Luce Bochaton-Piallat.Arterial Smooth Muscle Cell Heterogeneity: Implications for acute my ocardial inforation[J].Acta Cordiol,2007,62(5):445-451.

[5] Henry TD.Therapentic angiogenesis[J].BrMed J,1999(318):1536

[6] 霍勇,高炜,丁文惠.心肌梗死[M].沈阳:辽宁科学技术出版社,2003:417

[7] 寇壬花,崔志清.大黄治疗心血管疾病的药理学研究浅识[J]. 中医药学刊,2003,21(2):1692-1693.

[8] 谢华,马越鸣,王天明,等.桃核承气汤及单味大黄中大黄酸在家兔体内的药代动力学[J].中药药理与临床,2005,21 (2).

[9] 商学敏. 中药学[M] . 北京:人民卫生出版社,2000.

[10] 宫晔,陈衔成,鲍伟民.脑出血后脑组织水,离子变化及水蛭素的作用[J].上海医科大学学报,2000,27(2):105.

[11] 张涛,杜兰萍,崔平,等.水蛭和丹参对血管成形术后平滑肌细胞增殖影响的实验研究[J].中国中西医结合杂志,1998,18(3):159-161.