干扰STAT3的siRNA真核表达载体对人卵巢癌的侵袭转移性的相关研究

[摘要] 目的：通过构建针对STAT3的siRNA真核表达载体，研究STAT3对卵巢癌SKOV3细胞侵袭转移能力的影响。方法：使用软件Primer Premier 5设计siRNA靶序列，在合成修饰靶序列之后，构建siRNA-STAT3-脂质体复合物，并转染卵巢癌SKOV3细胞；通过Western blot检测细胞STAT3的表达，通过Transwell小室及对卵巢癌SKOV3细胞侵袭相关蛋白MMP-2的检测，探讨siRNA-STAT3对卵巢癌细胞侵袭力的影响。结果：构建干扰STAT3的siRNA真核表达载体转染SKOV3细胞可显著抑制细胞中STAT3的蛋白表达；与SKOV3细胞对照组和SKOV3细胞阴性对照组相比，SKOV3细胞siRNA-STAT3组中细胞侵袭转移能力明显下降。结论：构建干扰STAT3的siRNA真核表达载体可有效抑制STAT3的表达及卵巢癌SKOV3细胞的侵袭转移能力。

[关键词] 信号传导和转录激活因子3；卵巢癌；侵袭转移；RNA干扰

[中图分类号] R737.31 [文献标识码]A[文章编号]1673-7210（2011）08（a）-025-03

The study on relationship between STAT3 eukaryotic expression vector of small interference RNA and invasion and metastasis of ovarian cancer

SUN Jing1, SHAO Shuli2

1.The Second Clinical Hospital of Shanxi Medical University, Shanxi Province, Taiyuan 030001, China; 2.Department of Gynecology, Shanxi Provincial Cancer Hospital, Taiyuan 030013, China

[Abstract] Objective: To construct small interference RNA (siRNA) expression vector of the signal transducer and activator of transcription 3 (STAT3), and take a research on the form and transfer ability of ovarian cancer cells (SKOV3). Methods: STAT3 specific oligonucleotides were designed by software Primer Premier 5, and siRNA-STAT3-LipofectamineTM2000 complex was constructed after combining and embellishing the target sequences, a transfection was made in ovarian cancer cells (SKOV3), the expression of STAT3 was detected by Western blot way, transwell matrigel invasion assays was used to test the invasive power, and the protein expression level of MMP-2 was examined by Western blot analysis, transfer inlfluence of the ovarian cancer cells was explored by siRNA-STAT3. Results: The protein expression levels of STAT3 in ovarian cancer cells (SKOV3) were decreased with transfection of siRNA-STAT3, and in the siRNA-STAT3 transfection group, the invasion and proliferation ability ofovarian cancer cells were greatly suppressed which group compared with SKOV3 control group and SKOV3 negative control group. Conclusion: siRNA eucaryotic expression vectors which inhabit the expression of STAT3 genescan effectively suppress the invasion and proliferation ability of ovarian cancer cells (SKOV3).

[Key words] Signal transducer and activater of transcription 3; Ovarian cancer; Invasion and metastasis; RNA interference

卵巢癌是妇科常见的恶性肿瘤之一，由于其早期症状不典型且较隐匿，较早就可发生转移和广泛播散，且目前仍缺乏早期有效的诊断技术，患者就诊时75%～85%皆已属临床晚期[1]，因而死亡率极高。近年来研究发现，信号传导和转录激活因子3（signal transducer and activater of transcription，STAT3）信号转导通路在肿瘤的发生和发展中起重要作用[2]，特别是在促进肿瘤细胞增殖、抑制肿瘤细胞凋亡、促进侵袭转移及免疫逃逸方面的作用尤为重要[3-4]。正常的卵巢细胞里无STAT3活化，而在多种卵巢癌细胞株中发现STAT3呈过度激活表达，本研究利用RNA干扰技术，构建siRNA（Small interference RNA）-STAT3来沉默STAT3癌基因的表达，从而了解STAT3对卵巢癌细胞体外侵袭与转移影响，为卵巢癌的基因治疗探索一条新的途径。

1 材料与方法

1.1 材料

pSilencer2.1-U6-neo质粒购自Ambion 公司，各种酶为大连Takara生物公司产品，STAT3单克隆抗体购自北京中杉金桥生物技术有限公司， LipofectamineTM 2000脂质体购自Invitrogen 公司，Transwell小室购自美国Corning公司，Matrigel基质胶购自美国BD公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养人卵巢癌细胞株SKOV3细胞和人正常卵巢细胞均采用含10% FBS的RPMI1640细胞培养基，常规培养于5%CO2的37℃温箱中，每隔2 d更换细胞培养液，当细胞养至80%~90%融合时，用0.25%胰酶消化传代。

1.2.2 STAT3、siRNA转录模板的设计及合成[5]从GenBank中查找人STAT3基因的全长序列，根据siRNA的设计原则，设计STAT3特异寡核苷酸序列，在设计的寡核苷酸序列两端分别引入两个酶切位点，加入9个碱基对的茎环结构，3′末端加有转录终止序列TTTTT，以形成发夹状siRNA寡核苷酸链序列：STAT3正义链5′-GATCCATCCAGAGTCACTGGAAGTTTCAAGAGAAGTTCCAGTGACTCTGGATTTTTTTGTCGACA-3′，反义链5′-AGCTTGTCGACAAAAAAATCCAGAGTCCACTGGAACTTCTCTTGAAAGTTCCAGTGACTCTGGATG-3′。同时建立无同源性序列的non-target siRNA为阴性对照，正义链5′-GATCCTTCTCCGAACGTCTCACGTTTCAAGAGAACGTGCACG TTCGGAGAATTTTTTGTCGACA-3′，反义链5′-AGCTTGTCGACAAAAAATTCTCCGAACGTGTCACGTTCTCTTGAAACGTGACACGTTCGGAGAAG-3′（由上海博亚公司合成）。

1.2.3 siRNA-STAT3表达载体的构建将合成的引物退火缓冲液作用下退火，与经过BglⅡ、HindⅢ双酶切的质粒pSilencer2.1-U6-neo连接，热转化至大肠杆菌DH5α中，37℃过夜培养，碱裂解法快速抽提质粒。

1.2.4 细胞转染将处于对数生长期的SKOV3细胞和人正常卵巢细胞经0.25%胰蛋白酶消化后制成细胞悬液，接种于24孔培养板，于37℃、5%CO2培养箱内培养，保证转染时细胞汇合达70%~80%；将LipofectamineTM 2000用无血清培养液稀释，然后将稀释的siRNA-STAT3、空质粒与稀释的LipofectamineTM 2000，轻轻混合均匀后放于37℃、5%CO2培养箱内培养24 h后，吸去无血清培养液，加入含10%FBS的细胞培养基继续培养。

1.2.5 Western blot检测STAT3蛋白的表达实验分成五组：正常卵巢细胞对照组、正常卵巢细胞siRNA-STAT3组、SKOV3细胞对照组、SKOV3细胞空质粒转染组及SKOV3细胞siRNA-STAT3组。提取各组细胞总蛋白，定量后用蛋白上样缓冲液调整浓度，取25 μg上样，进行SDS-PAGE电泳，将蛋白转移至硝酸纤维素膜上，常规封闭后，加入一抗4℃过夜，再加入用辣根过氧化物酶标记过的二抗37℃下孵育2 h，ECL显色。

1.2.6 Transwell侵袭小室及侵袭相关蛋白MMP-2的检测将SKOV3细胞对照组、SKOV3细胞空质粒转染组及SKOV3细胞siRNA-STAT3组细胞用含1%FBS的培养基配制成细胞悬液，调整细胞浓度为5×108个/L，取稀释好的Matrigel 25 μl加入Transwell小室底部膜的上室面，覆盖整个聚碳酯膜，放入37℃培养箱中孵育30 min，使Matrigel聚合成凝胶，取配制好的细胞悬液100 μl加入小室上室面，然后将24孔板下室加入600 μl含20%FBS的培养基于37℃、5%CO2培养箱内常规培养24 h后，取出小室上室，用PBS洗两遍，然后用湿棉签轻轻擦去凝胶和聚碳酯膜上的细胞，小心取出上室，用冰预冷的甲醇固定30 min后，行Giemsa染色。在高倍镜下（×200）随机选取10个不同视野的肿瘤细胞进行计数，取平均数。将三组细胞蛋白提取出后，按Western blot检测STAT3蛋白的表达的步骤检测侵袭相关蛋白MMP-2的表达水平。

1.3 统计学方法

采用SPSS 11.3统计软件进行分析，数据以均数±标准差（x±s）表示，两样本均数比较采用t检验，以P

2 结果

2.1 Western blot检测转染细胞STAT3蛋白的表达

正常卵巢细胞对照组、正常卵巢细胞siRNA-STAT3组、SKOV3细胞对照组、SKOV3细胞空质粒转染组和SKOV3细胞siRNA-STAT3组的STAT3蛋白相对表达量分别为（0.33±0.19）、（0.33±0.06）、（0.83±0.14）、（0.82±0.18）、（0.35±0.18）。SKOV3细胞siRNA-STAT3组STAT3蛋白表达水平降低，差异有统计学意义（P

1.正常卵巢细胞对照组；2.正常卵巢细胞siRNA-STAT3组；3.SKOV3细胞对照组；4.SKOV3细胞空质粒转染组；5.SKOV3细胞siRNA-STAT3组

图1 siRNA-STAT3对各组细胞中STAT3蛋白表达水平的影响

2.2 siRNA-STAT3对卵巢癌细胞侵袭能力的影响

与SKOV3细胞对照组和SKOV3细胞空质粒转染组相比，SKOV3细胞siRNA-STAT3组穿过基底膜的细胞数显著减少（P

2.3 siRNA-STAT3对卵巢癌细胞中侵袭转移相关蛋白表达水平的影响

SKOV3细胞siRNA-STAT3组中MMP-2蛋白的表达水平降低，差异有高度统计学意义（P0.05）。见图2、表2。

3 讨论

STAT3是近些年来发现的一种重要的核转录因子，是JAKs 激酶-信号转导和转录活化因子（JAKs-STATs）转导途径中的一员，对肿瘤的发生发展起着重要作用。STAT3在人体正常组织中很少或没有活化，而在乳腺癌、头颈部鳞状细胞癌（SCCHN）、卵巢癌、前列腺癌、恶性黑色素瘤、宫颈癌、淋巴瘤、多发性骨髓癌和各种白血病等中存在持续激活的STAT3蛋白[6]，已被归为癌基因。Briggs等[7]发现，STAT3可在血管内皮生长因子（VEGF）基因启动子区域由结合位点持续激活，诱导VEGF表达，导致肿瘤新生血管形成，进而参与肿瘤的发生和发展。此外，基质金属蛋白酶类（MMps）中MMP-2的基因启动子内部也存在有STAT3的高亲和力结合位点，STAT3活化后能直接调节MMP-2表达，MMP-2参与对细胞外基质和基底膜的降解，促使卵巢癌细胞发生浸润与转移[8]。

RNA干扰（RNAi）是近些年来发现、逐渐发展起来的一种新兴基因阻断技术，它是将靶基因所对应的小分子双链RNA（double-stranded RNA， dsRNA）导入有机体，通过降解细胞内同源mRNA来产生特异的基因沉默作用，进而阻断细胞定基因的表达[9]。Kunigal等人研究发现，应用RNAi技术沉默STAT3基因表达，能够抑制某些癌细胞增殖功能和诱导癌细胞发生凋亡[10-11]。

本实验利用RNA干扰技术，构建STAT3目的基因的发夹状siRNA表达载体，通过脂质体介导将siRNA-STAT3转染到卵巢癌SKOV3细胞中，使siRNA发挥沉默作用，抑制卵巢癌细胞中STAT3 mRNA的表达，阻断STAT3通路。同时，利用Transwell侵袭实验及对侵袭相关蛋白MMP-2表达水平的检测来判断其对卵巢癌细胞侵袭性与转移性的影响。实验结果表明：siRNA-STAT3组中STAT3蛋白表达水平降低、穿过人工基底膜的细胞数显著减少、侵袭相关蛋白MMP-2表达水平降低，表明干扰STAT3的表达能明显抑制卵巢癌SKOV3细胞的侵袭转移能力。在卵巢癌的治疗过程中，最关键的因素是控制肿瘤侵袭和转移。Vermeij等[12]在对52例浸润上皮性卵巢癌患者的检测发现，如果抑制STAT3的表达，可减少卵巢癌细胞的生长与侵袭转移发生。因此，STAT3有可能成为判断卵巢癌侵袭转移的一项重要指标，同时也为卵巢癌的基因治疗提供了新的途径。

[参考文献]

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[3]张真发,马建群,孙楠,等.非小细胞肺癌中STAT3与MAPK的表达及临床意义[J].中国肿瘤临床,2004,31(20):1167-1170.

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[7]Xu Q, Briggs J, Park S, et al. Targeting STAT3 blocks both HIF-1 and VEGF expression induced by multiple oncogenic growth signaling pathways [J]. Oncogene,2005,24(36):5552-5560.

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[10]Klosek SK, Nakashiro K, Hara S, et al. Stat3 as a molecular target in RNA interference-based treatment of oral squamous cell carcinoma [J]. Oncol Rep,2008,20(4):873-878.

[11]Kunigal S, Lakka SS, Sodadasu PK, et al. Stat3-siRNA induces Fas-mediated apoptosis in vitro and in vivo in breast cancer [J]. Int J Oncol,2009,34(5):1209-1220.

[12]Vermeij J, Teugels E, Bourgain C, et al. Genomic activation of the EGFR and HER2-neu genes in a significant proportion of invasive epithelial ovarian cancers [J]. BMC Cancer,2008,8:3.

（收稿日期：2011-04-08）