甘草内生真菌的分离及产黄酮类化合物菌株的筛选

摘要：对甘草根、茎、叶中的内生真菌进行分离，并采用黄酮物质显色反应法对42株内生真菌的发酵液进行检测，结果显示，共得到菌株42株，其中26株分离自根，9株分离自茎，7株分离自叶。其中10株菌的显色反应呈阳性，说明能够产生黄酮类物质，这10株菌中，有7株来自根，1株来自茎，2株来自叶。进一步利用比色法对这10株菌发酵液中的总黄酮含量进行了测定，结果表明，菌株GF1—8、GF3—5、GF3—2有较高的黄酮产量，发酵液中总黄酮含量分别为0.138 mg · mL—1、0.125 mg · mL—1、0.102 mg · mL—1，3株菌均分离自根。

关键词：甘草；内生真菌；黄酮；分离；筛选

中图分类号：R284 文献标识码：A DOI编码：10.3969/j.issn.1006—6500.2012.05.004

Isolation of Licorice Endophytic Fungi and Screening of Flavones—producing Strains

LI Yan—bin1，2， ZHANG Qin1，2

（1. College of Life Science， Tarim University， Alaer 843300， China； 2. Xinjiang Production and Construction Corps Key Laboratory of Protection and Utilization of Biological Resources in Tarim Basin， Tarim University， Alar 843300， China）

Abstract： Endophytic fungi were isolated from licorice root， stem and leaf， 42 strains were selected in total， 26 strains isolated from root and 9 from stem， 7 from leaf. The fermentation liquids of 42 endophytic fungi were examined by characteristic color reaction of flavones， the results showed that 10 strains showed positive color reaction， indicating the flavones—producing potential of the 10 strains， among the 10 strains， 7 isolated from root， 1 from stem， 2 from leaf. Then the total flavones concentration in fermentation liquids of the 10 strains were examined by spectrophotometry， the results showed that three strains numbered GF1—8， GF3—5， GF3—2， which all isolated from root， produced high yield of flavones， the flavones concentration in fermentation liquids of the three strains were 0.138 mg · mL—1， 0.125 mg · mL—1， 0.102 mg · mL—1 separately.

Key words： licorice； endophytic fungi； flavones； isolation； screening

甘草（Glycyrrhiza）属多年生豆科草本植物，是我国传统中药中最常用的草药之一，素有“国老”之誉。甘草黄酮是甘草重要的活性成分之一，具有抗氧化、抗病毒、抗肿瘤、增强免疫力等作用[1—4]，在医药保健、食品添加剂、化妆品等方面应用广泛。甘草主产于我国东北、华北、西北各干旱贫瘠地区，具有固沙绿化的重要作用，因此，甘草被政府列为保护药材，禁止滥挖。近年来人工种植甘草得到较快发展，但因其生长周期长、收益慢，仍不能满足市场对甘草药材的需求。

植物内生菌是指在其生活史中某一时期生活在健康植物组织内，但不引起植物产生病害症状的微生物，包括真菌、放线菌和细菌[5—6]。内生菌可以产生与宿主植物相同或相似的生理活性物质，自1993年Stierle等[7]从红豆杉中发现能产紫杉醇的内生真菌后，近些年相继有研究表明许多药用植物内生菌能够产生类似宿主植物药效成分的生物活性物质[8—11]，且主要以内生真菌为主[12]。与从植物中提取活性物质相比，微生物具有生长繁殖快，发酵成本低，易培养，易控制，不受气候与地域等自然条件的限制，易于通过现代生物技术改造遗传性状等优点，对保护药材资源和保证药物供应等有重要的意义。因此，植物内生菌已成为筛选与宿主相同或相似的有益代谢产物的研究热点。

已有研究表明，甘草中也有较为丰富的内生菌资源，但利用甘草内生菌生产活性产物仍缺乏系统的研究。本研究拟从甘草中大量分离内生真菌，并对其中能产黄酮类物质的菌株进行了初步筛选，以期为利用内生真菌发酵法生产甘草黄酮提供基础材料和科学依据。

1 材料和方法

1.1 材料与试剂

于2010─2011年不同季节在塔里木大学周围采集健康甘草植株，分根、茎、叶3部分用自来水清洗干净，晾干备用。

柚皮苷，购自美国Sigma公司。其余化学试剂均为国产分析纯。