利用胚挽救技术创制葡萄多倍体种质的研究

摘 要: 为培育三倍体无核葡萄新品种，以二倍体欧洲葡萄无核品种红宝石无核、爱莫无核、黎明无核和欧山杂种北醇及四倍体欧美杂种藤稔、黑奥林为亲本，进行了红宝石无核×藤稔、黎明无核×藤稔、爱莫无核×黑奥林、藤稔×北醇、黑奥林×北醇5个组合的杂交，通过胚挽救技术获得杂种幼苗41株。在此基础上，利用流式细胞术、染色体计数的方法对所获得的杂种幼苗进行了早期倍性鉴定，结果表明有10株杂种为三倍体，6株为四倍体，4株为非整倍体，其余21株为二倍体。这将为进一步选育出三倍体无核葡萄新品种和提供新的育种材料奠定基础。

关键词: 葡萄；多倍体； 胚挽救； 流式细胞术； 染色体计数； 育种

中图分类号：Ｓ６６3．1 文献标志码：Ａ 文章编号：１００９－９９８０（２０12）０2－0269－０5

Study on breeding polyploidy grape by embryo rescue techniques

SHI Yan1，2，3，ZHANG Jian-xia1，2，3，WANG Yue-jin1，2，3*，TANG Dong-mei1，2，3，ZHANG Chao-hong1，2，3

（1College of Horticulture，Northwest A & F University， Yangling， Shaanxi 712100 China； 2Key Laboratory of Horticultural plant Biology and Germplasm Innovation in Northwest China， Ministry of Agriculture of China，Yangling， Shaanxi 712100 China； 3State Key Laboratory of Crop Stess Biology in Arid Areas， Northwest A&F University， Yangling， Shaanxi 712100 China）

Abstract: For the purpose of breeding triploid grape， five cross combinations including Ruby Seedless (Vitis vinifera) × Fujiminori (V. vinifera × V. labrusca)， Dawn Seedless (V. vinifera) × Fujiminor (V. vinifera× V. labrusca)， Emerald Seedless (V. vinifera) × Black Olimpia (V. vinifera × V. labrusca)， Fujiminori × Beichun（V. vinifera × V. amurensis）and Black Olimpia × Beichun were performed and embryo rescue techniques were employed. As a result， 41 hybrid seedlings were obtained. Furthermore， the chromosome ploidy of these hybrids was measured by flow cytometry and chromosome identification. The results showed that the hybrids were made up of 10 triploid plants， 6 tetraploid plants， 4 aneuploid plants and 21 diploid plants. This study will provide a foundation for further breeding triploid varieties and new breeding materials in grape.

Key words: Grape； Polyploid； Embryo rescue； Flow Cytometry； Chromosome identification； Breeding

多倍体育种是培育果树新品种的重要途径。多倍体植株通常表现为生长旺盛、枝粗、叶厚、果大、产量高及适应性强等特点，而多倍体产生途径有自然芽变、人工化学诱变、人工有性杂交、胚乳培养及花药培养等[1]。葡萄是全球第2大水果，无核葡萄是当前国际消费的重要方向，培育大粒无核葡萄品种一直受到葡萄育种家的重视。三倍体葡萄除具有多倍体植株的诸多优势外，还具有果实无核或少核的特点，因此三倍体葡萄育种开辟了培育大粒无核葡萄品种的新途径。二倍体和四倍体何者做母本，对葡萄杂交和胚挽救效果具有重要影响。山下裕之等[2]利用有核葡萄的四倍体和二倍体杂交，经胚珠培养获得三倍体植株，其中2x×4x组合的胚发育率和成苗率分别为15.6%～22.1%和7.3%～12.5%；4x×2x组合的胚发育率和成苗率分别为72.4%～78.8%和32.2%～42.4%，可见以四倍体做母本明显优于二倍体做母本。许多研究也认为[3-7]，采用常规二倍体和四倍体品种间杂交，具有很大的杂交障碍，育种效率极低。前人[6-10]报道了采用二倍体与四倍体品种间杂交及胚挽救获得了杂种后代。但以上研究均未见有对杂种后代进行倍性的检测报道。我们选用二倍体欧洲无核葡萄品种与四倍体品种、四倍体品种与二倍体欧山杂种北醇共进行了5个组合的杂交，通过胚挽救技术获得了部分杂种幼苗，以期进一步选育出葡萄多倍体新品种；在此基础上，结合流式细胞术、染色体计数对所获杂种后代进行了早期倍性鉴定，旨在建立一套创制葡萄多倍体育种的方法，为今后的多倍体育种提供技术依据。

1 材料和方法

1.1 材料及仪器

试验于2007-2008年在农业部西北地区园艺作物生物学与种质创制重点实验室和旱区作物逆境生物学国家重点实验室完成，其中流式细胞术测定在华中农业大学作物遗传改良国家重点实验室完成。

葡萄杂交在西北农林科技大学葡萄种质资源圃进行。杂交亲本选用二倍体欧洲葡萄种子败育型无核品种红宝石无核（Ruby Seedless）、爱莫无核（Emerald Seedless）、黎明无核（Dawn Seedless），欧山杂种北醇（V. vinifera × V. amurensis）以及四倍体欧美杂种藤稔（Fujiminori）、黑奥林（Black Olimpia），共5个杂交组合（表1，表2）。

流式细胞仪为德国Pratec公司生产的Ploidy Analyser（PA-1型），照相设备为日本原产OLMPUS-BX51。

1.2 方法

1.2.1 多倍体葡萄胚挽救程序 按常规方法去雄授粉，红宝石无核×藤稔、黎明无核×藤稔、爱莫无核×黑奥林、藤稔×北醇、黑奥林×北醇分别于授粉后48、42、47、52、55 d采取果穗剥取胚珠进行离体培养。胚挽救程序参照李桂荣等[11]的方法并加以改进，采用B5为胚珠培养的基本培养基，附加0.5 mg・L-1 BA、2.0 mg・L-1 IAA、0.5 mg・L-1 GA3、6%蔗糖、0.6%琼脂、0.1%活性炭；培养8周后，以WP为胚萌发基本培养基，附加0.1 mg・L-1 IBA、2%蔗糖、0.6%琼脂、0.1%活性炭；继续培养10～15 d进行继代培养，采用1/2MS为成苗基本培养基，附加0.1 mg・L-1 IBA、2%蔗糖、0.6%琼脂、0.1%活性炭。

1.2.2 流式细胞仪检测倍性 采用流式细胞术[12]测定供试材料DNA含量，初步鉴定杂种后代的倍性。取少量幼嫩的叶片或愈伤组织放入Pratec公司专制的培养皿中，加入0.5～1.0 mL的DNA提取液HR-A，用刀片切碎后静置2～5 min后，将样品通过30 μm的Partec CelltricsTM微孔膜过滤到测试管中，再加入2 mL染色液HR-B，随即将样品上样，DNA的含量分布图由流式细胞仪自动生成。首先将父母本品种所产生的分析峰在横轴上的荧光值FL设定，固定参数，再依次对杂种幼苗的荧光值进行测定。每测试1O个材料后，对父母本品种重做1次测试，以防止因为机器发热等原因造成数据的不稳定。

1.2.3 细胞学染色体计数法检测倍性 利用染色体计数的方法进一步测定杂种幼苗的倍性。采用低渗去壁火焰干燥法染色体计数[13-14]，并简化成以下步骤: （1）预处理: 在超净工作台上取杂种试管苗的根尖或茎尖后，立即投入饱和的对二氯苯溶液中常温下处理 2～3 h；（2）固定: 去除处理液，用蒸馏水冲洗数遍后注入新配制的甲醇∶冰乙酸=3∶1的固定液，常温下处理3 h以上；（3）酶解: 去除固定液，用蒸馏水冲洗干净，加入 3.5%的纤维素酶和果胶酶 1∶1 的混合酶液，酶液和材料的比例为 30∶1，在 37 ℃恒温下酶解 20～30 min；（4）染色: 蒸馏水冲洗后在卡宝品红染色液中染色 30 min 以上；（5）压片镜检观察，取一小块材料放在载玻片上，滴上一滴卡宝品红染色液，用镊子捣碎后盖上盖玻片，然后按压住一角用木制小棒均匀敲打盖玻片，至材料分散成雾状，用吸水纸吸去多余的染色液后，酒精灯上干燥，再用OLMPUS-BX51型显微数码摄影系统照相。

2 结果与分析

2.1 胚挽救技术培养获得的杂种后代及成苗情况

分别以二倍体无核品种和四倍体有核品种为母本进行了不同倍性的葡萄品种杂交，可以看出，以二倍体无核品种为母本的不同杂交组合中，红宝石无核×藤稔的胚萌发率最高，达23.1%，明显大于黎明无核×藤稔的胚萌发率3.39%，说明相同的父本，不同母本杂交胚的萌发率差异较大（表1）；此外，黑奥林×北醇的胚萌发率33.3%，明显大于藤稔×北醇的胚萌发率17.3%，同样说明不同母本，杂交胚萌发率差异明显（表2）；而以四倍体作母本的组合，黑奥林×北醇胚萌发率为所有5个组合中最高，明显大于以种子败育型无核二倍体品种为母本的组合。总体来看，不同组合的胚萌发率存在明显差异，说明不同亲本基因型对胚萌发率的影响显著。各组合成苗率除黎明无核×藤稔外均在50%以上，红宝石无核×藤稔最高，达87.5%（表1，表2）。胚珠培养至成苗过程见图版-A~D。

2.2 流式细胞仪对杂种后代的分析结果

通过流式细胞术对5个组合的杂种幼苗共41个单株幼嫩的叶片进行测定，分别将各杂交组合父母本产生的分析峰在横轴上DNA含量荧光值FL设定，固定参数，二倍体品种为50（图1-A），四倍体品种为100（图1-B），依次测定各供试材料DNA含量的荧光值，并与各自设定参数进行对比，结果有二倍体、三倍体、四倍体、非整倍体几种不同的倍性水平（表3，图1），三倍体10株，分别为6株红宝石无核×藤稔杂交后代和4株黑奥林×北醇杂交后代；四倍体6株，分别为1株红宝石无核×藤稔杂交后代、1株黑奥林×北醇杂交后代和4株藤稔×北醇杂交后代；非整倍体4株，分别为1株红宝石无核×藤稔杂交后代和3株藤稔×北醇杂交后代；其余21株均为二倍体。

2.3 细胞学染色体计数对胚挽救杂种的倍性分析结果

通过简化的实验方法，对供试的5个组合所得的杂交后代已通过流式细胞仪测定出的结果，进行进一步茎尖组织染色体鉴定。结果表明，父母本中二倍体材料染色体数目为38条（图版-E），四倍体材料染色体数目为76条，而杂交后代中存在多种情况，如非整倍体（图版-F）、三倍体（图版-G）、四倍体（图版-H），其鉴定结果基本与流式细胞术的测定结果一致。

3 讨 论

多倍体育种，尤其是三倍体育种技术是获得优良无子品种的有效方法之一，如三倍体西瓜[15]、三倍体柑橘[16]、三倍体香蕉[17]、三倍体甜菜[18]等。在多倍体葡萄育种上，日本已育成三倍体无核葡萄品种尾玲（Yileyi）、戴拉王（King Dela）、蜜无核（Honey Seedless）、甲斐美（Kai Mirei）、夏黑（Summer Black），我国已育成的三倍体无核早红（Earlyred Seedless），并在生产上开始推广[3]。多倍体育种最有效的途径是采用二倍体和四倍体直接杂交，但二倍体和四倍体杂交的最大障碍是亲和力差、坐果率低、杂种胚早期败育或胚乳解体、获得三倍体杂交种子生活力低，从而很难获得杂交后代。国内外学者[6-10]采用胚挽救技术，克服了葡萄二倍体与四倍体杂交中获得三倍体杂种胚早期败育、育种效率低的障碍，成功的获得了三倍体杂种，极大地拓宽了葡萄育种的范围，提高了育种效率，但对所得杂种幼苗进行倍性鉴定的报道较少。

本研究通过二倍体与四倍体葡萄杂交，经胚挽救技术培养获得部分杂种后代，采用流式细胞术快速全面地进行半定量分析后，再进一步通过染色体计数法加以直观的验证，较为系统地对获得的杂种后代进行了倍性的早期检测。结果表明，本研究中所用二倍体无核品种红宝石无核、爱莫无核、黎明无核，以红宝石无核作母本较好，而以四倍体品种黑奥林作母本比藤稔好，说明不同的杂交组合，胚萌发率存在明显差异，尤其是相同父本，不同母本的杂交胚萌发率差异较大，这也说明杂交组合母本基因型对胚萌发率有明显的影响；而与以二倍体为母本的组合相比较，以四倍体为母本的组合胚萌发率较高，这与郭印山等[4]、徐海英等[10]的研究存在差异，这可能是由于本研究中选用的二倍体品种为种子败育型无核品种，杂交障碍较大；但以四倍体品种为母本获得的三倍体幼苗的比例比以二倍体为母本的高，这与郭印山等[4]、Yang等[5]的研究结果相一致。此外，本研究采用二倍体无核品种为母本，除选育出三倍体杂种后代外，所获得的杂种幼苗含有无核基因的比率将大大提高。因此，今后的多倍体育种研究中，除了继续优化多倍体育种技术体系外，还应注意杂交亲本的选择与选配，以获得更多的多倍体杂种后代，提高育种效率。（本文图版见封底）

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