BTH诱导甜瓜愈伤组织活性氧代谢和抗性酶活性的信号途径

摘 要: 通过对含有苯并噻二唑（BTH）、咖啡酸（CA）或氯化钴（CC）等不同MS培养上甜瓜愈伤组织的研究，测定了超氧阴离子（）产生速率、过氧化氢（H2O2）含量及抗性相关酶活性的变化，探讨了BTH诱导的甜瓜ROS代谢和抗性酶活性及其相关的信号途径。结果表明，CA可以消除BTH对甜瓜愈伤组织增加和H2O2积累的诱导作用； CA或CC能够部分抵消BTH对SOD增强的诱导作用； CC对BTH诱导的POD增强具有抑制效应，CA+CC可完全消除BTH对POD的诱导作用；CA和CC均能促进BTH对PAL增强的诱导作用，且具有协同效应。BTH对甜瓜升高、H2O2积累和CAT降低的诱导主要通过SA途径实现，对POD的影响主要通过ET途径实现，对SOD升高的诱导通过SA和ET 2条途径实现，而对PAL活性的影响通过ET和SA以外的途径实现。

关键词： 甜瓜； 苯并噻二唑； 咖啡酸； 氯化钴； 活性氧； 抗病相关酶； 信号途径

中图分类号：Ｓ６52 文献标志码：Ａ 文章编号：１００９－９９８０（２０12）０2－0246－０7

The signal pathway of melon calli ROS metabolism and defensive enzyme activities induced by BTH

WANG Chun-lin1，3， ZHANG Yu-xin2， CHEN Nian-lai1，2*， DAI Chun-yan2， FANG Chun-yuan2， KANG En-xiang2

（1Agronomy College， Gansu Agricultural University， Lanzhou，Gansu 730070 China； 2College of Resources and Environment，Gansu Agricultural University， Lanzhou，Gansu 730070 China； 3Long Dong College，Qingyang，Gansu 745000 China）

Abstract: The melon calli were cultured in dark （25±2) ℃ on MS medium contained 5 mmol・L-1 coffeic acid （CA) and/ or 10 mmol・L-1 CoCl2 （CC)， while benzothiadiazole （BTH） were sprayed on the calli. The production rate of ， content of H2O2 and the activities of SOD，CAT，POD，PPO，PAL were determined. The result showed that CA inhibited the induction of BTH on rate， H2O2 production and CAT decrease. While CC stimulated rate， but had no effect on BTH induced H2O2 production and CAT decrease. Either CA or CC could partially inhibit the increase of SOD activity induced by BTH， and CA+CC completely counterbalanced the effect of BTH on SOD. CC eliminated POD increase induced by BTH， while CA showed no effect on this. Both CA and CC promoted the increase of PAL induced by BTH. These results demonstrate that the induction of BTH on CAT activity， rate and H2O2 production is through SA-dependent pathway， the induction of BTH on POD activity is through ET-dependent pathway， and the effect of BTH on SOD activity is through SA- and ET-dependent pathways， while the induction of BTH on PAL may be via signal transduction other than SA- or ET-dependent pathway.

Key words: Melon； Benzothiadiazole； Coffeic acid； Cobalt chloride； Reactive oxygen species； Defensive enzymes； Signal pathway

通过研究和分析植物抗病信号转导途径在诱导机制和抗病机制中的作用，有助于我们利用相关基因并培育具有广谱、高抗的转基因植物。活性氧（ROS，Reactive oxygen species）是植物寄主-病原物非亲和性互作过程中发生的早期事件之一[1-2]。ROS在植物抗病过程中具有杀菌、引发过敏反应、加强细胞壁、促进植保素合成等作用，还是植物抗病信号转导中的第二信使[3-4]。静息细胞内的ROS被控制在很低的范围，当细胞受到各种生理或病理因素作用时，多种细胞外信号分子作用于膜受体，ROS被受体活化诱导而“有目的”地快速增加，从而作为细胞内信号分子参与细胞增殖，分化和凋亡等各种细胞行为[5]。植物为了将活性氧的量严格限制在一定的浓度范围内，而进化出了一系列复杂的酶促与非酶促降解途径来清除活性氧，维持活性氧的动态平衡[6]。在植物的保护酶系中，超氧化物歧化酶（SOD）是主要的活性氧清除酶系，它氧化迸发过程产生的歧化为O2和H2O2；POD 不仅是H2O2水解的主要酶之一，而且在特定的条件，也能与NADPH 等反应产生H2O2，生成的H2O2用于细胞壁的木质化或蛋白质的交联；过氧化氢酶（CAT）使H2O2转化为H2O和O2[7]。

植物体内至少存在2条主要的抗病信号转导系统，其中一条依赖于水杨酸（Salicylic acid，SA），介导过敏反应、系统获得抗性和激活防御基因的表达，并通过与多个细胞因子的相互作用对植株抗性产生广泛的影响，称之为SA-依赖性途径（SA-dependent pathways）；另一条依赖于茉莉酸/乙烯（Ethylene，ET），介导系统诱导抗性，称为SA-非依赖性途径[8]。植物体内的SA是通过苯丙烷途径合成的，肉桂酸-4-羟化酶是其中SA合成的关键酶[9]。咖啡酸（caffeic acid，CA）可以抑制SA合成途径中的肉桂酸-4-羟化酶，进而降低SA含量[10]。ET合成酶是ET生物合成途径中最后一个酶，催化1-氨基环丙烷-1-羧酸向乙烯的转化，是组织培养过程中ET合成的限速酶，Co2+能强烈抑制其活性[11]。苯并噻二唑（Benzothiadiazole，BTH）是人工合成的植物诱抗剂，能够诱导许多重要的农作物产生对病原菌广谱和持久的抗性[12]。BTH可诱导甜瓜幼苗对白粉病的抗性[13-14]和抗性相关酶活性增强[15]。但关于BTH诱导ROS代谢和抗性相关酶活性增强的信号途径几乎没有报道。我们用BTH处理培养在含SA或/和ET合成抑制剂（CA或/和CoCl2）的MS培养基上的甜瓜愈伤组织，通过监测愈伤组织ROS及相关酶活性变化，探讨BTH诱导甜瓜抗病性产生的信号途径，以期进一步阐释BTH诱导植物抗病性的生化机理，为植物诱导抗性的应用和抗病机制研究提供更多理论依据，促进诱导抗病性技术在实践中的应用。

1 材料和方法

1.1 材料和处理

供试甜瓜品种为Tam Dew和卡拉克赛。Tam Dew是白兰瓜品种，高抗白粉病；卡拉克赛又名伽师瓜，是我国著名哈密瓜品种，易感白粉病[16]。

选取子粒饱满的甜瓜种子去壳，在75%的医用酒精中浸泡30 s、再在0.1%升汞中浸泡并摇晃6 min，用无菌水冲洗5~6次后播种在1/2 MS培养基上，置于（25±2） ℃的光照培养箱中发芽。取幼嫩子叶转接到1/2MS +2.4-D（0.1 mg・L-1）+6-BA （1.0 mg・L-1）的培养基上诱导愈伤组织。选择长势良好的愈伤组织，分别作以下处理，处理1：将愈伤组织转接到含5 mmol・L-1的SA合成抑制剂咖啡酸的1/2 MS培养基上；处理2：将愈伤组织转移到含10 mmol・L-1 的ET合成抑制剂CoCl2（CC）的1/2 MS培养基上；处理3：将愈伤组织转移到含5 mmol・L-1 咖啡酸 + 10 mmol・L-1 CoCl2的1/2 MS培养基上；处理4：将愈伤组织转接到不含咖啡酸或CoCl2的1/2 MS培养基上。用1 mL注射器给上述愈伤组织喷洒BTH（50 mg・L-1）溶液（约1 mL・15 g FW），以无菌水喷洒处理4愈伤组织为对照，在（25±2） ℃下暗培养。于处理后0、2、4、6、8 d取培养瓶中的愈伤组织进行ROS和酶活性测定。

1.2 测定指标与方法

1.2.1 产生速率 参照宗会等[17]的方法测定，取甜瓜愈伤组织0.3 g，加入5 mL 10 mmol・L-1的盐酸羟胺，真空渗入15 min，于30 ℃温箱中温育45 min，生成NO2。吸取2 mL样品溶液，与1 mL 17 mmol・L-1的对氨基苯磺酸和1 mL 7 mmol・L-1 α-萘胺充分反应，10 min后取上清液，在530 nm测其吸光值。

1.2.2 H2O2含量 参照林植芳等[18]的方法测定，取甜瓜愈伤组织0.3 g，按1∶2（w∶v）加入预冷的丙酮提取。取1 mL提取液加0.1mL 20%TiCl4的浓盐酸液、0.2 mL浓氨水，生成的过氧化物-Ti复合物在3 000 r・min-1离心10 min。沉淀用丙酮悬浮洗涤5次。最后将沉淀溶于3 mL 1 mol・L-1的硫酸中，用在410 nm波长下测定吸光值。

1.2.3 SOD 活性测定 取愈伤组织0.3 g于冰冻研钵中，加3 mL预冷的0.05 mol・L-1 BPS（pH 7.8）在冰浴上研磨成浆，4 ℃，10 000 r・min-1下离心20 min，上清液即为粗酶液。活性测定参照李合生[19]的NBT（氮蓝四唑）光化还原法，以抑制NBT光化还原50%的酶量为1个酶活力单位。

1.2.4 POD 活性测定 取愈伤组织0.3 g于冰冻研钵中，加3 mL预冷的0.05 mol・L-1 BPS（pH 6.0）在冰浴上研磨成浆，4 ℃，3 000 r・min-1离心10 min，上清液即为粗酶液。活性测定参照李合生[19]的愈创木酚法。

1.2.5 PAL活性测定 参照李合生[19]的方法，取愈伤组织0.3 g，加5 mL含5 mmol・L-1 β-巯基乙醇硼酸缓冲液（pH8.8）、0.5 g聚乙烯吡咯烷酮（PVP）在研钵中研磨，于10 000 r・min-1下离心15 min，上清液为酶液粗提液。取上清液1.0 mL，加入1.0 mL 0.02 mol・L-1苯丙氨酸、2.0 mL蒸馏水，总体积为4 mL。置恒温水浴30 ℃保温0.5 h，以每小时在290 nm处吸光度变化0.01所需酶量为1个酶活性单位。

1.2.6 CAT活性测定 酶液提取同SOD，活性测定参照邹琦[20]的紫外吸收法。

1.3 数据分析

利用SPSS 16.0 统计软件进行单因素方差分析，差异显著性测验采用Duncan 法，作图软件为Excel。

2 结果与分析

2.1 咖啡酸和CoCl2对BTH诱导的甜瓜愈伤组织ROS代谢的影响

2.1.1 咖啡酸和CoCl2对BTH诱导的甜瓜愈伤组织产生速率的影响 BTH处理后，2个甜瓜品种愈伤组织产生速率均显著增加，抗病品种Tam Dew的增加幅度大于感病品种卡拉克赛（图1）。CA+BTH处理后2个品种产生速率与对照相当，表明咖啡酸可以抑制BTH所诱导的甜瓜愈伤组织产生速率的增加。产生速率在CC +BTH和CA+CC+BTH处理中均显著高于对照和BTH处理，其中CA+CC+BTH处理的愈伤组织中产生速率最高，说明CoCl2能促进BTH对甜瓜愈伤组织产生的诱导作用，且CoCl2能恢复咖啡酸的抑制作用。

2.1.2 咖啡酸和CoCl2对BTH诱导的甜瓜愈伤组织H2O2含量的影响 BTH处理后甜瓜愈伤组织H2O2含量迅速增加（图2），且显著（P＜0.05）高于对照。CC+BTH处理后两品种H2O2积累量与BTH处理基本一致；CA+BTH或CA+CC+BTH处理后2品种H2O2积累量与对照没有显著差异。表明咖啡酸可以抑制BTH对甜瓜愈伤组织H2O2积累量增加的诱导作用，CoCl2对BTH诱导的H2O2积累没有显著影响，但CoCl2能抵消咖啡酸对BTH作用的抑制效应。

2.2 咖啡酸和CoCl2对BTH诱导甜瓜愈伤组织抗性酶活性的影响

2.2.1 咖啡酸和CoCl2对BTH诱导甜瓜愈伤组织SOD活性的影响 BTH诱导后甜瓜愈伤组织SOD活性显著（P＜0.05）高于对照（图3），卡拉克赛的SOD活性峰值比Tam Dew出现的较晚，约为2 d。CA+BTH和CC+BTH处理后2品种甜瓜愈伤组织的SOD活性都高于CK，但低于BTH处理；CA+CC+BTH处理后的SOD活性与CK相当。说明，单独使用咖啡酸或CoCl2能够部分抵消BTH对甜瓜愈伤组织SOD活性增强的诱导作用，2者共存时则能有效抑制BTH的诱导作用。

2.2.2 咖啡酸和CoCl2对BTH诱导甜瓜愈伤组织CAT活性的影响 BTH处理显著降低了甜瓜愈伤组织的CAT活性，处理后6~8 d Tam Dew的CAT活性受到更大的抑制（图4）。CA+ BTH和CA+CC+BTH处理后CAT活性与CK间无显著差异； CC+BTH处理后CAT活性与BTH处理相当。表明CoCl2对BTH诱导的甜瓜愈伤组织CAT活性无显著影响，而咖啡酸可以消除BTH对CAT活性的抑制作用。

2.2.3 咖啡酸和CoCl2对BTH诱导甜瓜愈伤组织POD活性的影响 图5所示，BTH处理后甜瓜愈伤组织POD活性显著增强，且抗病品种Tam Dew的POD活性大幅上升。CA+BTH处理的POD活性与BTH处理相当； CC+BTH处理后POD活性呈先下降而后缓慢升高的趋势，但显著低于BTH处理，表明CoCl2对BTH诱导的POD活性增强具有抑制效应；CA+CC+BTH处理完全消除了BTH的诱导作用，愈伤组织POD活性与CK相当。

2.2.4 咖啡酸和CoCl2对BTH诱导甜瓜愈伤组织PAL活性的影响 BTH处理能促进甜瓜愈伤组织PAL活性明显增强，抗病品种Tam Dew的增幅大于感病品种卡拉克赛（图6）； CA+BTH、CC+BTH和CA+CC+BTH处理的PAL活性均显著高于BTH处理，CA+CC+BTH处理的PAL活性最高。表明咖啡酸和CoCl2均能促进BTH对甜瓜愈伤组织PAL活性增强的诱导作用。此外，它们可能对PAL活性升高具有直接作用，且咖啡酸和CoCl2在增强PAL活性方面具有协同效应。

2.3 甜瓜愈伤组织ROS代谢与抗病相关酶活性的相关性

对ROS含量变化与抗病相关酶活性的相关分析结果（表1）显示，2品种甜瓜愈伤组织PAL活性与产生速率和H2O2含量极显著正相关，SOD活性与H2O2含量极显著正相关，CAT活性与产生速率显著负相关，SOD活性与CAT极显著负相关、而与POD和PAL活性呈极显著正相关，说明不论基础抗性高低，甜瓜的ROS清除均与SOD、PAL、CAT活性密切相关。

3 讨 论

3.1 BTH诱导甜瓜愈伤组织ROS代谢的信号途径

BTH处理能够显著提高甜瓜愈伤组织产生速率和H2O2含量，抗病品种产生速率和H2O2积累量高于感病品种，与BTH诱导甜瓜叶片抗病性提高的结果相一致[21]；咖啡酸处理抑制了BTH对产生速率和H2O2含量的诱导作用，表明其阻断了BTH对甜瓜ROS信号途径的诱导作用；CoCl2处理促进了BTH对产生速率的诱导，而对H2O2含量没有影响。结果表明，BTH处理诱导甜瓜愈伤组织产生速率和H2O2积累量的增加，不受ET途径的影响，BTH可能通过SA等途径影响ROS积累。

3.2 BTH诱导甜瓜愈伤组织抗病相关酶活性的信号途径

CoCl2对BTH诱导的甜瓜愈伤组织CAT活性影响不显著，而咖啡酸可以消除BTH对CAT活性的抑制作用，表明BTH对CAT活性的抑制是通过SA途径实现的。单独使用咖啡酸或CoCl2只有部分消除BTH对SOD活性增强的诱导作用，而咖啡酸和CoCl2共存几乎完全消除了BTH的作用，说明BTH能通过SA和ET 2条途径诱导SOD活性增强；CoCl2对BTH诱导的甜瓜愈伤组织POD活性具有抑制效应，而咖啡酸对BTH的诱导效应无影响，表明BTH对POD活性的诱导主要通过ET途径实现。CoCl2或咖啡酸及CoCl2+咖啡酸对BTH诱导的PAL活性增强均无抑制作用，表明BTH诱导PAL活性增强不依赖于SA或ET途径。相反咖啡酸和CoCl2还有可能作为化学逆境因子促进PAL的活性。严文文等[11]研究证明，咖啡酸明显促进茉莉酸甲酯（MJ）对PAL活性诱导而又明显降低SA含量，咖啡酸可能抑制了SA合成途径中肉桂酸-4-羟化酶的活性。本试验结果与严文文等[11]研究咖啡酸和CoCl2对茉莉酸甲酯诱导烟草PAL活性的结果一致。BTH对PAL活性的影响可能是通过ET或SA以外的途径，咖啡酸和CoCl2对PAL活性增强具有协同效应，BTH对PAL活性的诱导途径尚需进一步研究。

3.3 BTH诱导的甜瓜愈伤组织ROS代谢与抗病相关酶活性的关系

研究指出，ROS快速积累对诱导植株防卫反应非常重要[22]。H2O2代谢主要由SOD、CAT和POD控制，SOD可将歧化为H2O2，而POD和CAT 可降解H2O2。PAL是植物莽草酸代谢途径的关键酶和限速酶，在木质素的积累、植保素和酚类物质的合成中均具有重要作用。在特定的条件，POD能与NADPH 等反应产生H2O2，生成的H2O2能介导木质素合成以及HRGP在细胞壁中的氧化交联[23]。2品种甜瓜愈伤组织PAL活性与产生速率和H2O2含量极显著正相关，SOD活性与H2O2含量极显著正相关，CAT活性与产生速率显著负相关，而与POD和PAL活性呈极显著正相关，说明不论基础抗性高低，甜瓜的ROS清除均与SOD、PAL、CAT活性密切相关。感病品种（卡拉克赛）H2O2积累量与CAT极显著负相关、而与PAL不相关，抗病品种（Tam Dew）H2O2积累量与PAL极显著负相关、而与CAT不相关，说明不同抗性甜瓜品种维持ROS平衡的生化机制有差异。

4 结 论

BTH处理对甜瓜产生速率升高、H2O2积累和CAT活性降低的诱导主要通过SA途径实现，对POD活性的影响主要通过ET途径实现，对SOD活性升高的诱导通过SA和ET 2条途径实现，而对PAL活性的影响通过ET和SA以外的途径实现。

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