肿瘤转移关键酶

作者：李燕杰， 李吉学，彭清忠，汤国营， 林艳丽， 郭瑞锋，朱厚础

【关键词】 ,肝素裂合酶

Cloning of fulllength heparanase gene and expression of functional heparanase in mammalian cells

【Abstract】 AIM: To explore the expression character of heparanase by isolating the full encoded gene and expressing the functional enzyme in mammalian cells. METHODS: We isolated the full encoded heparanase gene from human placenta cDNA library, cloned the gene into eukarytic expression vector pCDNA4/MycHis, transfected it into COS7 cells and CHO cells and then screened the CHO cells which permanently expressed heparanase in the selected medium. RESULTS: The activity of heparanase in the mammalian cell lysate detected was much higher than that in the culture medium. The molecular mass of the heparanase protein expressed in the transfected COS7 and CHO cells was about 53×103 (Mr) by western blot. CONCLUSION: The fulllength heparanase gene is isolated. The functional heparanase is expressed within COS7 and CHO cells and few heparanse is secreted into medium. The positive CHO cells expressing active heparanase is screened, which will help explore its function and screen its antibody and antagonists from a variety of sources.

【Keywords】 heparin lyase; gene expression; COS7 cells; CHO cells

【摘要】　目的： 分离出乙酰肝素酶(heparanase, HPA)全长编码基因并在哺乳动物细胞中表达出有活性的HPA；探索此酶在哺乳动物细胞中的表达特性；并建立稳定表达该酶的细胞株. 方法：通过PCR法从人胎盘cDNA文库中扩增HPA蛋白全长编码基因；构建真核表达载体，转化COS7细胞进行瞬时表达；分析HPA蛋白的活性和表达特性；转化入CHO细胞以筛选恒定表达该酶的细胞株. 结果：分离扩增出1629 bp的人HPA全长cDNA序列并构建了其真核表达载体；在转染后的COS7细胞和筛选出的CHO细胞裂解液中检测到较高的HPA活性和相对分子质量(Mr)大小约53×103的目的蛋白免疫印迹表达带. 结论：本研究分离出人HPA编码基因全序列；在真核细胞内成功表达出有活性的人HPA，发现此酶在COS7和CHO细胞中表达在细胞内，很少分泌到细胞外；筛选出其恒定表达细胞株，为进一步研究HPA结构功能、开发其抗体及抑制剂提供了有力的工具.

【关键词】 肝素裂合酶；基因表达；COS7细胞；CHO细胞

0引言

乙酰肝素酶（heparanase, HPA）是一种内源性β葡萄糖醛酸酯酶，识别硫酸乙酰肝素蛋白多糖（heparan sulfate proteoglycan，HSPG）的多糖侧链硫酸肝素链（heparan sulfate, HS）的特异结构，并将其降解为10～20个糖单位大小的短糖链［1］ ，该酶破坏细胞外基质和基底膜，降低细胞间质屏障功能，促进肿瘤细胞侵入基质和血管壁［2］，在肿瘤转移过程中起重要作用［3,4］. HPA是迄今发现的唯一的作用于细胞外基质多聚糖成分的酶，为我们提供了一个抗肿瘤转移的新药物靶点. 得到编码HPA蛋白的全基因，构建、筛选有效的蛋白表达载体和细胞株，是进一步研究人HPA功能特性，以及研发抗HPA药物等的重要基础和前提. 我们拟分离出HPA编码基因的全序列，在真核细胞中表达完整并具有活性的HPA蛋白，探索此酶在哺乳动物细胞中的表达特性，并筛选恒定表达完整HPA蛋白的CHO细胞株，为进一步的研究提供基础.

1材料和方法

1.1材料

大肠杆菌TOP10感受态细胞购自Invitrogen公司； COS7，CHO细胞株由军事医学科学院生物工程研究所保存； pGEMT载体由军事医学科学院生物工程研究所保存；真核表达载体pCDNA4/MycHis购自Invitrogen公司；人胎盘cDNA文库购自Clontech公司. 总RNA提取试剂盒（SV Total RNA Isolation System），反转录试剂盒（ImPromIITM Reverse Transcription System），质粒提取试剂盒均购自Promega公司；凝胶回收纯化试剂盒购自Qiagen公司；Heparan Deagrading Enzyme Assay Kit购自日本TAKARA公司. 限制性内切酶PstⅠ， XhoⅠ， T4 DNA连接酶，PCR扩增所用试剂为TAKARA公司产品；培养基RPMI 1640 ，胎牛血清，Zeocin，脂质体LIPOFECTAMINE 2000购自Invitrogen公司；mouse AnticMyc Antibody和AntiMouse IgGHRP购自Invitrogen公司.

1.2方法

1.2.1分离乙酰肝素酶蛋白编码基因及测序鉴定上游引物ATGCTGCTGCGCTCGAAGCCTGCGCT，下游引物TCAGATGCAAGCAGCA ACTTTGGCAT，由塞百盛公司合成. 以人胎盘cDNA文库为模板，进行PCR. PCR条件为：94℃ 3 min，变性进入循环；94℃ 30 s， 56℃ 30 s, 72℃ 30 s，30个循环后72℃继续延伸5 min. 8 g/L琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR产物后采用Promega公司的回收试剂盒纯化PCR产物，直接克隆入pGEMT载体，送联合基因公司测定基因序列.

1.2.2构建乙酰肝素酶真核表达载体pCDNA4/MycHisHPA使用含有PstI和XhoI酶切位点的引物CTGCAGATGCTGCTGCGCTCGAAGCCTGCGCT， CTCGAGTCAGATGCAAGCAGCAACTTTGGCAT扩增乙酰肝素酶cDN段，将此片段和真核表达载体pCDNA4/MycHis分别用PstⅠ和XhoⅠ进行酶切消化，切胶回收，于16℃连接过夜，转化TOP10感受态细胞. 挑取阳性克隆提取质粒，用酶切和测序法鉴定目的基因.

1.2.3转染COS7细胞采用脂质体法转染，具体方法如下： 培养细胞生长到90%～95%汇合时，将50 μL无血清DMEM培养基与0.8 μg pCDNA4/MycHisHPA质粒混合, 50 μL 无血清DMEM培养基与2.5 μL脂质体混合，室温下孵育5 min，然后将以上二者混合，室温下孵育20 min. 待脂质体和质粒的混合微粒形成，将此混合液接种于培养孔内，轻摇培养板，混匀. 在37 ℃， 50 mL/L CO2条件下的培养箱培养. 72 h后收集细胞用于检测.

1.2.4筛选阳性细胞株① Zeocin的敏感浓度测定： CHO细胞培养至80%汇合，以每孔2000个细胞接种培养板；细胞贴壁后，加入Zeocin，使每行孔内Zeocin的终浓度分别为0，10，20，30，40和50 mg/L；继续培养80 h，期间每10 h计算培养孔中的细胞数. 作出生长曲线，以抑制细胞生长浓度的一半为最低敏感浓度，筛选浓度定为敏感浓度的2倍. ② 使用Zeocin筛选阳性细胞株： pCDNA4/MycHisHPA质粒转染CHO细胞，方法同上. 48 h后传代细胞. 继续培养细胞直到细胞贴壁，使细胞生长密度不超过25%汇合度，倒出培养基，加入含有筛选浓度Zeocin的选择培养基继续培养；18 h后，将细胞以3×103/ cm2的密度传代至选择培养基中，每4日换选择培养基1次；然后采用有限稀释法进行单克隆筛选. 将阳性集落转移到含有选择培养基的24孔组织培养板继续培养，当孔中的细胞长到80%汇合度，转移到6 cm2组织培养皿中，用选择培养基扩大培养，传代后，按常规法冻存.

1.2.5阳性细胞鉴定① 检测mRNA： 收集细胞，提取细胞总RNA，进行RTPCR，如有特异性扩增带出现则为阳性克隆. ② 检测表达蛋白： 用Lowry法测定各样品中的蛋白浓度，取等量蛋白用Western blot方法检测融合在乙酰肝素酶蛋白C末端的cMyc标签，按常规法进行.

1.2.6检测乙酰肝素酶活性采用Heparan Degrading Enzyme Assay Kit检测分析细胞HPA的生物活性［5］. 按试剂盒说明书测定标准品，绘制活力标准曲线. 然后从以下样品中取等量蛋白测定乙酰肝素酶的活性：未经转染的COS7细胞裂解液；含空载体PCNA4/MycHis的COS7细胞裂解液；含载体PCNA4/MycHisHPA的COS7细胞培养液；含载体PCNA4/MycHis HPA的COS7细胞裂解液；未经转染的CHO细胞裂解液；含空载体PCNA4/MycHis的CHO细胞裂解液；含载体PCNA4/MycHisHPA的阳性CHO细胞培养液；含载体PCNA4/MycHis HPA的阳性CHO细胞裂解液.

2结果

2.1人乙酰肝素酶基因的分离扩增与鉴定PCR扩增产物在8 g/L琼脂糖凝胶电泳胶上呈单一特异性条带（Fig 1）. 经序列测定和比较，此基因为人HPA全长编码基因.

2.2HPA真核表达载体的构建与鉴定提取阳性质粒PCNA4/MycHisHPA，用PstⅠ， XhoⅠ酶切鉴定，在5.1 kb和1.6 kb处有两条电泳带，与预期结果相符（Fig 2）. 将阳性重组子送测序公司测序，阅读框架正确，无移码，序列没有突变，可以进行表达.

2.3COS7细胞中乙酰肝素酶蛋白的检测转染后48 h收集细胞，对细胞裂解液和培养基进行Western blot检测，发现细胞裂解液中可见一免疫印迹条带，Mr约为53×103，在培养基中未检测到免疫印迹条带（Fig 3）.

2.4Zeocin的最低敏感度在zeocin 的培养基中，抑制细胞生长一半的浓度为25 mg/L，定为最低敏感浓度，筛选浓度为敏感浓度的2倍：50 mg/L. 细胞的生长曲线见Fig 4.

2.5CHO细胞中HPA mRNA和蛋白的检测筛选出的4个阳性细胞集落扩大培养后，收集细胞，提取细胞总mRNA，反转录合成cDNA. 以cDNA作为模板，以相应引物进行PCR扩增，PCR扩增产物在8 g/L琼脂糖凝胶上呈单一特异性电泳条带，大小为1.6 kb，与预期一致(Fig 5). 在4株阳性细胞中均可检测到特异的蛋白免疫印迹条带(Fig 6).

2.6HPA活性测定在转染了PCNA4/MycHisHPA的细胞裂解液中检测到较高的乙酰肝素酶的活性，分别为14.37，12.75，13.30，12.55和14.27 nkat；在未转染或转染空载体的细胞裂解液及转染了PCNA4/MycHisHPA的细胞培养液中的酶活性很低，分别为0.60，0.87，0.93，0.54，0.52和1.45 nkat（Fig 7）. 由此认为转染了HPA基因的COS7细胞和筛选出的CHO阳性细胞株均表达有活性的HPA蛋白，且大部分有活性的HPA定位于细胞内. 在细胞培养液中检测到的HPA活性远远弱于细胞内，提示HPA没有或很少被COS7和CHO细胞分泌到细胞外.

3讨论

本研究选用胎盘cDNA文库为模板，首次在国内分离出人HPA编码基因全序列. 将全长基因克隆入真核表达载体，在哺乳动物细胞中表达出有活性的HPA蛋白. 在检测HPA在哺乳动物细胞中的表达特性时发现：检测细胞中此酶的mRNA长度为1.6 kb，显示细胞完整转录了HPA全长编码基因，可以翻译出完整的HPA蛋白. 而对细胞裂解液蛋白的Western blot分析显示，蛋白Mr为53×103，小于完整蛋白的分子质量. 分析此差异认为：在细胞中全长编码基因被翻译成Mr为61.5×103的多肽，此多肽在随后的加工的过程中被切割，其N端的信号肽、小亚基被未知的蛋白水解酶切除［6］，余下的C端50×103大亚基与载体上的Myc表位肽标签蛋白融合，Mr的总和53×103. 用Myc抗体检测到的免疫印迹条带为此融合蛋白. 而其N端的多肽没有与标签蛋白连接，不能被检测到. 此结果进一步验证了HPA在蛋白水平被加工而成为有活性的酶这一成熟过程.

另外，本研究还发现，在细胞裂解液中检测到了大量的HPA蛋白，表明HPA蛋白在细胞中大部分定位于细胞内. 为探索此酶是否被分泌到细胞外，我们对细胞培养液中的蛋白进行免疫印迹检测，没有发现条带. 随后，我们又对各样本HPA的活性进行了检测，发现在细胞培养液中检测到的HPA活性远远弱于细胞内，活性检测结果与免疫印迹结果相一致. 提示HPA大部分定位于COS7和CHO细胞内，没有或很少被分泌到细胞外. 此结果与Orit Goldshmidt的研究相符［7］. 提示HPA在生理条件下位于细胞内，其表达和分泌受到严格的调控，以免其过度表达分泌对细胞外HSPG错误切割而造成组织损伤，发生各种病变. 而在肿瘤细胞中，不仅其表达水平增加而且其调控机制发生紊乱，HPA被大量分泌到细胞外基质中从而促进肿瘤细胞转移，此机制需进一步深入研究.

【参考文献】

［1］ Pikas DS, Li JP, Vlodavsky I, et al. Substrate specificity of heparanases from human hepatoma and platelets ［J］. Biol Chem, 1998; 273(30): 18770-18777.

［2］ Vlodavsky I, Friedmann Y, Elkin M, et al. Mammalian heparanase: Gene cloning, expression and function in tumor progression and metastasis ［J］. Nat Med, 1999;5(7): 793-802.

［3］ Elkin M, Ilan N, IshaiMichaeli R, et al. Heparanase as mediator of angiogenesis: Mode of action ［J］. FASEB J, 2001,15(9):1661-1663.

［4］ Vlodavsky I, Friedmann Y. Molecular properties and involvement of heparanase in cancer metastasis and angiogenesis ［J］. J Clin Invest, 2001;108(8):341-347.

［5］ Behzad F, Brenchley PE. A multiwell format assay for heparanase ［J］. Anal Biochem, 2003;320(2): 207-213.

［6］ Fairbanks MB, Mildner AM, Leone JW, et al. Processing of the human heparanase precursor and evidence that the active enzyme is a heterodimer ［J］. J Biol Chem, 1999;274(42): 29587-29590.

［7］ Goldshmidt O, Nadav L, Aingorn H, et al. Human heparanase is localized within lysosomes in a stable form ［J］. Exp Cell Res, 2002;281(1): 50-62.