两面针叶抗菌活性部位研究

[摘要] 目的 研究两面针叶不同溶剂萃取部位对6种菌株的抗菌活性，为评价两面针叶抗菌活性部位提供实验依据。 方法 应用液体试管两倍稀释法测定两面针叶不同提取部位对大肠埃希菌、乙型副伤寒沙门菌、枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、白色念珠菌、副溶血性弧菌等菌株进行最低抑菌浓度和最低杀菌浓度测定。 结果 乙酸乙酯部位对其中的4个菌株有抑菌活性，它们的抑菌活性依次为：副溶血性弧菌、白色念珠菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌；正丁醇部位对白色念珠菌的抑菌活性最好，其最低杀菌浓度（MBC）和最低抑菌浓度（MIC）分别为750 μg/mL和375 μg/mL；水层对副溶血性弧菌抗菌活性最强；其MBC和MIC分别为750 μg/mL和375 μg/mL。 结论 乙酸乙酯部位、正丁醇部位及水层对白色念珠菌、副溶血性弧菌均有较好的抗菌活性，可考虑综合应用两面针叶在抗菌活性方面的应用与研究。

[关键词] 两面针叶；抗菌活性；最低抑菌浓度

[中图分类号] R284.1 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2014）07（c）-0013-04

两面针Zanthoxylum nitidum（Roxb.） DC.为芸香科花椒属植物，作为中草药使用在民间已有悠久历史，其性味辛、苦、微温，有小毒，具有祛风通络、活血化瘀、行气止痛和消肿解毒之功效，用于治疗牙痛、胃痛、神经痛、咽喉肿痛、风湿痹痛、毒蛇咬伤及烧烫伤等。两面针作为中药材收载于《中国药典》2010版[1]，现代研究证明，两面针的提取物具有抗炎镇痛、抗癌及抗菌作用[2-10]，并对心血管系统和神经系统有显著的药理作用[11-12]。两面针为广西特色中草药资源植物，因其临床疗效好、用途广而至使市场上两面针药材供不应求。本研究组前期研究对两面针根和茎的抗炎镇痛不同部位活性及其抗菌部位进行了活性研究报道[13-14]，在前期研究基础上，本研究组继续开展两面针叶的抗菌药理活性实验，为寻找活性先导化合物或抗菌活性化学成分及考察是否可合理地扩大两面针药用植物资源提供科学的实验依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验药物

两面针叶采自广西壮族自治区南宁市邕宁县，凉干后粉碎成粗粉，生药标本由广西中医药研究院赖茂祥研究员鉴定为芸香科（Rutaceae）花椒属植物两面针Zanthoxylum nitidum（Roxb.） DC.植物的叶，凭证标本存放于广西医科大学药学院。两面针叶先用70%乙醇浸泡过夜，再回流提取4次，合并提取液，减压浓缩得稠膏，再以水一定比例的水混悬，接着用石油醚、乙酸乙酯和正丁醇分别依次萃取，浓缩得相应不同极性部位稠膏，冷冻干燥，将所得的各极性部位分别记为两面针叶的70%乙醇提取物（A）、乙酸乙酯部位（B）、正丁醇部位（C）及水层（D），并密封置冰箱中冷藏，临用前用磷酸缓冲液（pH=6.8）加10%DMSO溶解，配成1.5 mg/mL的母液，经0.22 μm微孔滤膜过滤，再逐级稀释成不同药液浓度。

1.1.2 菌种及培养基

乙型副伤寒沙门菌[CMCC（B）50094]、大肠埃希菌[CMCC（B）44102]、枯草芽孢杆菌[CMCC（B）63501]、金黄色葡萄球菌[CMCC（B）26003]、白色念珠菌[CMCC（F）98001]、藤黄八叠球菌[CMCC（B）28001]、短小芽孢杆菌[CMCC（B）63202]、铜绿假单胞菌[CMCC（B）10104]、福氏志贺菌[CMCC（B）51572]均来源于广西食品药品检验所；表皮葡萄球菌[CMCC（B）26069]、乙型溶血性链球菌[ATCC17802]、单核细菌增生李斯特菌[CMCC（B）21663]、副溶血性弧菌[ATCC17802]购于广东环凯微生物科技有限公司。MH琼脂培养基（批号3101197）、MH肉汤培养基（批号201111072）购自广东环凯微生物科技有限公司；改良马丁培养基（批号110302）、营养肉汤培养基（批号120320）、液体沙氏培养基（批号101130）、玫瑰红钠琼脂培养基（批号110118）及营养琼脂培养基（批号110406）均为北京路桥技术有限公司产品。

1.1.3 仪器

SPX-150型生化培养箱、BIO1200-Ⅱ-A1生物安全柜、LRH-250-G光照培养箱、LMQ・C/3260J立式压力蒸汽灭菌器。

1.2 方法

实验所用的的试管、培养基及溶剂等均经高压灭菌。

1.2.1 菌液的制备

1.2.1.1 菌种复苏 取各冻存管中的乙型副伤寒沙门菌、大肠埃希菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌、金黄色葡萄球菌、藤黄八叠球菌、短小芽孢杆菌、铜绿假单胞菌、福氏志贺菌、表皮葡萄球菌、乙型溶血性链球菌、单核细菌增生李斯特菌、副溶血性弧菌分别至一定量的营养肉汤培养基中，混匀，并置于35～36℃下培养18～24 h；将取自冻存管的白色念珠菌置改良马丁培养基中，混匀，23～28℃培养18～24 h。

1.2.1.2 实验菌液制备 细菌菌悬液：分别接种大肠埃希菌、乙型副伤寒沙门菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌、金黄色葡萄球菌、藤黄八叠球菌、短小芽孢杆菌、铜绿假单胞菌、福氏志贺菌表皮葡萄球菌、乙型溶血性链球菌、单核细菌增生李斯特菌、副溶血性弧菌至营养肉汤培养基中，35～36℃下培养18～24 h，作为各菌株的菌悬液。使用时用0.9%氯化钠溶液进行10倍系列稀释至所需浓度，计数。

真菌菌悬液：将白色念珠菌接种至改良马丁培养基中，25～28℃下培养24～48 h，作为菌悬液。使用时用0.9%氯化钠溶液对其进行10倍系列稀释至所需浓度，计数。

1.2.2 实验方法

1.2.2.1 预实验（平板挖沟法） 在琼脂平板中间挖一条宽5～10 mm的沟，注入药液。然后分别接种乙型副伤寒沙门菌、大肠埃希菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌、金黄色葡萄球菌、藤黄八叠球菌、短小芽孢杆菌、铜绿假单胞菌、福氏志贺氏菌、表皮葡萄球菌、乙型溶血性链球菌、单核细菌增生李斯特菌、副溶血性弧菌等13个受试菌，接种时，每1种菌划一条横越药沟的接种线，每个平板接种3～4种菌株。经适宜温度培养18～24 h后，观察沟旁细菌生长情况，以抑制距离的长短判断受试药物的抑菌作用和抑菌强度。

1.2.2.2 最低抑菌浓度（MIC）测定 用0.22 μm微孔滤膜将供试药液过滤除菌。取13支试管，每支试管加入MH肉汤培养基1.0 mL，再将1.0 mL供试药液加入第1管中混匀，然后吸取1.0 mL加入第2管中混匀，同法操作稀释至第12管，再从第12管中吸出1.0 mL置空试管中作空白对照，第13管作为阳性生长对照管，并将MH肉汤培养基和样品溶剂各0.5 mL加入另1空试管中作为溶剂对照管。除空白对照管外，各实验管均分别加入相应的菌悬液0.1 mL，各菌悬液浓度分别为：乙型副伤寒沙门菌1.3×104 CFU/mL、枯草芽孢杆菌6.1×104 CFU/mL、大肠埃希菌4.5×105 CFU/mL、副溶血性弧菌1.5×104 CFU/mL、金黄色葡萄球菌8.3×104 CFU/mL、白色念珠菌1.8×104 CFU/mL，使各实验液含菌终浓度为103～104 CFU/mL，混匀。将对枯草芽孢杆菌、大肠埃希菌、副溶血性弧菌、金黄色葡萄球菌的各实验管置于35～36℃下培养18～24 h，把白色念珠菌的实验管置25～28℃下培养24 h；取出观察结果，以摇匀后仍澄明（未见长菌）的最高稀释度作为实验药物的最低抑菌浓度。

1.2.2.3 最低杀菌浓度（MBC）测定 取最低抑菌浓度测定后的实验管，依次从对金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、副溶血性弧菌实验未见长菌的各实验管中，分别吸取0.1 mL的培养物涂布于MH琼脂培养基平板上，置30～35℃下培养24 h；再从对白色念珠菌实验未见长菌的实验管中，吸取0.1 mL培养物分别涂布于玫瑰红钠琼脂培养基平板上，于25～28℃下培养24 h；取出观察记录结果，以平板上小于5个菌落数的最小稀释度的药物浓度作为最低杀菌浓度。

2 结果

2.1预实验结果

两面针叶药液对上述13种受试菌株的实验中提示对乙型副伤寒沙门菌、大肠埃希菌、枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、白色念珠菌、副溶血性弧菌6株菌有抑菌作用。故取实验药液对后者分别进行最低抑菌浓度、最低杀菌浓度测定，同时，取硫酸庆大霉素分别对大肠埃希菌、乙型副伤寒沙门菌、枯草芽孢杆菌，取两性霉素B对白色念珠菌进行最低抑菌浓度作为对照。

2.2 MIC测定结果

两面针叶药液乙酸乙酯部位（B）、正丁醇部位（C）及水层（D）对白色念珠菌、枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、副溶血性弧菌均有不同程度的抗菌活性；对大肠埃希菌、乙型副伤寒沙门菌无抑菌活性，70%乙醇提取物（A）对所实验的6种菌株未见有抑菌活性。见表1。

2.3 MBC测定结果

实验药液乙酸乙酯部位（B）、水层（D）和正丁醇部位（C）对副溶血性弧菌和白色念珠菌的MBC均为750 μg/mL。见表1。

3 讨论

本次实验在对所研究的6个菌株中发现：除70%乙醇提取物，其余样品对白色念珠菌、枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、副溶血性弧菌有抗菌活性，其中对白色念珠菌、副溶血性弧菌的抗菌活性最佳，对白色念珠菌的MIC为375 μg/mL（乙酸乙酯部位、正丁醇部位）、750 μg/mL（水层），MBC为750 μg/mL（正丁醇部位）；乙酸乙酯部位、正丁醇部位对副溶血性弧菌的MIC均为375 μg/mL， MBC均为750 μg/mL；样品乙酸乙酯部位、正丁醇部位对枯草芽孢杆菌和样品乙酸乙酯部位、水层对金黄色葡萄球菌的MIC均为750 μg/mL。

两面针为多年生木质藤本植物，传统入药部位为根，广泛应用于精细化工、医药产品及中医处方中，因其生长周期长，市场用量大，有供不应求现象。文献报道两面针不同部位所含主要成分有别[15-16]，本研究组推测两面针植物的不同入药部位功效可能也有所不同，因而目前开展了两面针根、茎和叶不同提取部位的抗菌和抗炎镇痛活性实验[2，8，14]，本实验研究两面针叶的抗菌活性部位，为寻找抗菌活性化学成分或活性先导化学成分提供前期研究基础，为两面针植物资源的综合利用提供实验依据。

白色念珠菌作为重要的条件致病性真菌是引起根尖周炎，特别是顽固性根尖周炎及根管治疗失败三大菌种之一。近年来，随着广谱抗生素的大量使用及皮质类固醇激素的广泛使用，导致致病性白色念珠菌感染日渐增多，而抗真菌药物的大量使用使白色念珠菌的耐药现象越来越普遍，日益严重的耐药现象使白色念珠菌感染成为临床上迫切需要解决的问题[17-19]。副溶血性弧菌（Vibrio parahaemolyticus）作为广泛存在于海产品中的一种人畜共患病原菌，是人类食源性疾病最重要的病原之一，是细菌性食物中毒的重要致病菌。我国每年引起食物中毒的微生物病原中，该菌占首位[20]。由于水产养殖业中抗生素的大量使用，导致了副溶血性弧菌耐药性日益严重[22-23]，其耐药菌株可通过食物链进入人体，给目前的临床治疗带来巨大挑战。寻找、研发新型的抗菌药物迫在眉睫。

本实验中，两面针叶的乙酸乙酯部位对白色念珠菌、副溶血性弧菌有较好抑菌活性，正丁醇部位对白色念珠菌、水层对副溶血性弧菌的抗菌活性最强，70%乙醇总提取物没有表现出对实验菌株的抑菌活性，原因可能与实验抗菌的有效成分浓度较低有关。此研究为本研究组进一步深入研究两面针资源、寻找新的抗白色念珠菌、抗副溶血性弧菌的抗菌活性成分或开发植物源抗菌素新药研究提供科学实验依据。

[参考文献]

[1] 国家药典委员会.中国药典[S].一部.北京：中国医药科技出版社出版，2010：157.

[2] 韦锦斌，周劲帆，冯洁，等.两面针叶不同提取部位的抗炎镇痛作用研究[J].中药新药与临床药理，2013，24（2）：122-125.

[3] 樊洁，李海霞，王炳义，等.两面针中化学成分的分离鉴定及活性测定[J].沈阳药科大学学报，2013，30（2）：100-105，131.

[4] 韩正洲，仰铁锤，陈炜璇，等.两面针不同药用部位镇痛和保护胃黏膜作用的研究[J].中国现代中药，2013，（3）：178-182.

[5] 叶玉珊，刘嘉炜，刘晓强，等.两面针根抗菌活性成分研究[J].中草药，2013，44（12）：1546-1551.

[6] 王希斌，刘华钢，杨斌，等.两面针中木脂素化合物结晶-8对伤害性疼痛大c-fos基因表达的影响[J].医药导报，2012，31（9）：1113-1116.

[7] 肖开，闫欣，苗明三，等.两面针外用对豚鼠口腔溃疡模型的影响[J].中药新药与临床药理，2012，23（5）：533-537.

[8] 周劲帆，覃富景，冯洁，等.两面针根挥发油的抗炎镇痛作用研究[J].时珍国医国药，2012，23（1）：19-20.

[9] 徐露，黄彦，董志，等.两面针总碱对溃疡性结肠炎大鼠抗炎作用的实验研究[J].中国中医急症，2010，19（3）：480.

[10] 庞辉，何惠，简丽娟，等.两面针总碱抗胃溃疡作用研究[J].中药药理与临床，2007，23（1）：38.

[11] 刘华钢，黄秋洁，赖茂祥.中药两面针的研究概况[J].时珍国医国药，2007，18（1）：222-223.

[12] 李艳芝，王慧云.两面针化学成分及其药理活性研究进展[J].中国药房，2013，24（31）：2966-2968.

[13] 冯洁，周劲帆，覃富景，等.两面针根和茎抗炎镇痛不同部位活性比较研究[J].中药药理与临床，2011，27（6）：60-63.

[14] 黄依玲，冯洁，王海华，等.两面针根和茎的抗菌部位研究[J].中药药理与临床，2013，29（1）：103-105.

[15] 张守尧，巍育法，刘楚峰.不同部位两面针药材中两面针碱的含量测定[J].中药材，2001，24（9）：649-650.

[16] 张守尧，周本杰，汪艳.高效液相色谱法测定不同部位两面针原植物中L-芝麻脂素和L-细辛脂素的含量[J].第一军医大学学报，2002，22（7）：654-655.

[17] 许颖，郭婧玉，刘学，等.飞龙掌血乙醇提取物对白色念珠菌抑菌作用的研究[J].中国实验方剂学杂志，2012， 18（10）：270-274.

[18] 赵德军，付维婵，胡昭宇，等.我院2009-2011年白色念珠菌检出率及其对氟康唑的耐药性变迁[J].中国药房，2013，24（2）：146-148.

[19] 符健，贾杰，蔡笃运.白色念珠菌对临床常用抗真菌药物的耐药性分析[J].现代预防医学，2011，38（16）：3301-3302.

[20] 刘秀梅，陈艳，郭云昌，等.2005年中国食源性疾病暴发事件监测资料分析[J].中国食品卫生杂志，2008，20（6）：506-509.

[21] 胡婕，陈茂义，胡静荣.内陆地区市售水产品及环境中副溶血性弧菌血清群分布与耐药性[J].公共卫生与预防医学，2013，24（6）：32-35.

[22] 傅慧琴，苏靖华，章红红.318株副溶血性弧菌的血清分型和耐药性分析[J].疾病监测，2011，26（7）：539-542.

[23] 张育禾，徐丽萍，张朝阳，等.宁波地区副溶血性弧菌耐药性与分型[J].中国卫生检验杂志，2013，23（1）：28-32.

（收稿日期：2014-04-20 本文编辑：苏 畅）