小麦HMW―GS基因的定向缺失亚克隆法解析

摘 要：针对小麦中HMW-GS基因克隆的方法――定向缺失亚克隆进行了详细的解析，对各个步骤应注意的事项进行了归纳总结，为小麦中HMW-GS基因的克隆提供参考意见。

关键词：HMW-GS基因；克隆；定向缺失；测序

中图分类号：S512.1文献标识码：A

高分子量谷蛋白亚基（High-molecular-weight subunits，HMW-GS）是普通小麦（Triricum aestivum L.，BBDD，2n=6x=42）胚乳中的重要贮藏蛋白，其组成和含量影响小麦的加工品质。不同小麦品种的高分子量麦谷蛋白亚基（HMW-GS）基因有多个复等位基因。每个位点都有分别控制着x-型亚基（分子量较高）和y-型亚基（分子量较低）紧密连锁的基因[1，2]。正常表达的HMW-GS基因的编码区均不含有内含子，其编码的DNA序列由4个区域组成：信号肽序列（从起始密码子开始的一段63bp的核苷酸序列）；无重复的5′N-末端序列（x型亚基含有243～267bp，y型亚基含有312bp的核苷酸序列）；中央重复区序列（含有1200～2010bp的核苷酸序列），基因的DNA序列长度的差异，主要由基因中部的重复序列大小及重复次数的不同所引起，其变异主要是由该区域内DNA序列的插入或缺失造成的；无重复的3′C-末端区序列（含有312bp的核苷酸序列）。两个紧密相连的终止密码子TGATAG终止编码[3]。

定向缺失亚克隆法是对小麦及其近缘种属中HMW-GS亚基基因成功测序的独特方法。李辉[4]从百萨偃麦草中分离了一个长约1.8kb的1Ebx HMW-GS基因。孙霞[5]从西尔斯山羊草中克隆了49077-x亚基基因，双角山羊草中克隆了Y52-y亚基基因。Xiang和liu等[6]克隆了有芒冰麦的沉默的1By亚基基因。虽然有不少研究者对在HMW-GS亚基基因克隆中都采用了定向缺失亚克隆的方法，但有些初学者对此法理解不够，本文根据自己及前人的试验经验对此方法做详细的解释，为科研工作者进行研究提供方便。

1 方法解析

HMW-GS基因克隆分为以下几个步骤：全基因组DNA的提取――PCR扩增――PCR产物的亚克隆――定向缺失亚克隆――测序――序列拼接。

1.1 小麦全基因组DNA的提取

参照宋艳波等改良的3x CTAB法[14]。需要注意的是：提取DNA所用的叶片要鲜嫩，以便于提取的DNA量大且纯。

1.2 PCR扩增

小麦HMW-GS编码的基因序列长度在2000～3000bp，GC含量较高（参照1Dx5亚基基因序列长度，序列号：x12928）。反应总体系为20μL，所用的酶为LA Taq，buffer为2×GC buffer（均来自TAKARA公司）。需要注意的是：扩增长片段时，LA Taq酶是最佳选择，扩增效率高，可信度又高；GC buffer有Ⅰ和Ⅱ，Ⅱ的变性作用比Ⅰ更强一些，LA Taq和GC buffer同时使用来扩增GC含量较高又比较长的片段，效果较好。

反应条件：94℃预变性1min，94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸3min，38个循环，72℃延伸10min，4℃保存（扩增片断3000bp左右）。1.0%琼脂糖凝胶检测。需要注意的是：一般退火温度低于引物Tm值5～10℃，因为扩增片段较长（3000bp左右），延伸时间应适当延长（3min左右）和循环数（38个左右）适当增加。

1.3 PCR产物的亚克隆

PCR产物经1.0%琼脂糖凝胶电泳检测后，切下目的条带，用PCR产物纯化试剂盒回收DNA，连接到pMD18-T（TAKARA公司）或pGEM-T easy（promega公司）载体上，转化DH5α感受态细胞，在含有100mg/L氨苄青霉素的LB固体培养基[IPTG（1mol/L）4μL和X-ga1（20mg/mL）40μL]上进行蓝白斑筛选，挑取白色菌落培养，提取质粒用核酸内切酶进行双酶切鉴定。酶切鉴定目的是：挑选已连接有目的基因的质粒。选用内切酶时遵循的原则是：目的基因或载体上有内切酶的酶切位点。根据酶切位点估计切下来的片段大小，从而确定酶切是否彻底。

1.4 定向缺失制备亚克隆

因为小麦的HMW-GS基因的重复序列很多，用普通的测序方法在序列中间设计引物继续测序无法得到完整的序列，所以选用定向缺失制备亚克隆的方法，用载体上的引物完成每一段的测序后，再进行拼接，以提高测序的准确度。针对测序前的定向缺失亚克隆的方法重点提出几点解析。具体方法如下：

1.4.1 内切酶双酶切

总反应体系为60μL，其中含质粒DNA（目的基因+T载体）12μL/5μg，内切酶1 60U/5μL，内切酶2 80U/4μL，Buffer 6μL，H2O 33μL，37℃过夜。需要注意的是：所用的内切酶根据目的基因来定，基因内部不能含有这两种内切酶的酶切位点且酶切位点位于目的基因外的一侧，有一种内切酶的酶切位点靠近目的基因且使双链DNA产生一端3′凹陷末端DNA序列。完全酶切后，70℃加热10～30min，使内切酶失活。

1.4.2 外切酶酶切

外切酶ExoШ与双酶切产物结合，从产物切口处的3′凹陷末端开始酶切使双链DNA渐进切刻产生单链缺口，该酶对于单链DNA无活性。反应包括：双酶切产物 50μL，10×ExoШ Buffer 6μL，ExoШ 1μL（30～40U/μg），ddH2O 3μL，23℃酶切。酶切2，4，6，8，10，12，14…min（根据目的基因的长短决定酶切时间）后，各取5μL于新的PCR小管中，每次取出后放入70℃失活10min。需要注意的是：因为外切酶的酶切速度每分钟在200bp左右，每2min片段就会缩短400bp左右，每2min取1次样是为了得到相邻的片段之间相差400bp的梯度片段。因为测序时1次能测600bp左右，所以有200bp的重复序列便于进行序列的拼接。

1.4.3 核酸内切酶S1降解单链DNA

将各管的样品混合在同一PCR管内，按下列条件反应：样品50μL，10×S1 Buffer 10μL，ddH2O 39μL，Solution1 1μL，在23℃下反应15min，加入5μL 0.5mol/L EDTA至终浓度10mmol/L）。需要注意的是：核酸内切酶S1是一种高度单链特异的酶，在最适的酶催反应条件下，降解单链DNA，产生带5′-磷酸的单核苷酸或寡核苷酸。对双链DNA、双链RNA和DNA-RNA杂交体相对不敏感，所以用S1酶切，以去除单链，产生平末端。EDTA可以使S1酶失活。

1.4.4 用连接酶将链状DNA连接成环状DNA再亚克隆

再取10μL反应产物在20μL体积中连接过夜，其中连接酶缓冲液1μL，T4DNA连接酶1μL，回收PCR产物10μL，ddH2O 8μL，反应液于4℃连接过夜。70℃加热10min使连接酶失活，取10μL转化E.Coli DH5α感受态，再重复步骤1.3中亚克隆的部分。

1.5 挑选含有梯度的片段进行测序

对得到的克隆提取质粒后用T-载体上的测序引物（如PMD18-T中的M13-47和RV-M）进行PCR扩增，检测插入片段的大小，选出一个梯度缺失的亚克隆系列，这些克隆的插入片段长度处在600bp到未缺失的全基因插入长度，彼此之间相差300～400bp。取这一批缺失的序列梯度亚克隆，用测序引物对每一个缺失亚克隆进行一个测序反应。测序由测序公司完成。

1.6 序列拼接

将每个反应所测得序列，根据200bp左右的重复序列进行序列拼接，然后获得全长基因序列。

2 小 结

试验中还应注意以下几点：因为HMW-GS基因的同源性非常高，进行PCR扩增时可能会扩增出多条带，割胶回收时不能掺入杂带；用内切酶进行双酶切时要彻底；外切酶进行酶切时严格把握酶切时间并使酶快速失活，这是定向缺失的关键步骤；挑选含有梯度的PCR产物时，为了确保准确，同等大小的序列要多挑两个。

参考文献

[1]梁静静，，陈军营，等.小麦5+10亚基基因转化研究[J].麦类作物学报，2004，24（03）：5-8.

[2]王建军，康志钰，尚勋武.相同遗传背景下7+8与17+18亚基对面团流变学特性的影响[J].西北农业学报，2007，16（03）：68-71，99.

[3]DOvidio RP，E.Lafiandra，D.PCR analysis of genes encoding allelic variants of high-molecular-weight glutenin subunits at the Glu-D1 locus[J].Theoretical and Applied Genetics，1994，88：175-180.

[4]李辉.百萨偃麦草高分子量麦谷蛋白亚基基因的克隆及其遗传转化[D].北京：中国科学院遗传与发育生物学研究所博士研究生学位论文，2004：1-67.

[5]孙霞.西尔斯山羊草和双角山羊草高分子量麦谷蛋白亚基基因的分子克隆[D].东北农业大学，2004（05）.

[6]Weiwei Xiang，Baolong Liu，and Huaigang Zhang.Cloning and characterization of a y-type inactive HMW glutenin subunit gene from Triticum durum cultivar youmangbingmai[J].African Journal of Bio-technology，2010，9（07）：967-971.

[7]宋艳波，吴国良，牛洪斌.改良CTAB法在核桃叶片基因组DNA提取中的应用研究[J].山西农业大学学报（自然科学版），2011，31（02）：109-112.

作者简介：相微微（1982-），女，汉族，山东临沂人，硕士，助教，主要从事作物育种及品质改良研究。