多因素复合建立脾气虚证大鼠模型及以方测证研究

摘要 目的：以大黄法、游泳力竭法、饥饿法多因素复合建立一种新的脾气虚证大鼠模型。方法：动物随机分为对照组、模型组及中药组，以多因素复合法对模型组及中药组大鼠进行造模，21天后处理部分大鼠，检测指标。其余大鼠继续实验，以黄芪建中汤灌服中药组，生理盐水灌服对照组及模型组，21天后处理大鼠，检测指标。结果：造模大鼠血清木糖浓度、血清肌酸磷酸激酶活性、血清胃泌素水平下降，胃窦G细胞数减少，与对照组比较差异有统计学意义(P

关键词 多因素 脾气虚证 大鼠模型 以方测证

脾气虚证的造模方法虽多，但较多存在稳定性、重复性差等不足。本实验尝试采用大黄法、游泳力竭法、饥饿法多因素复合的方法制作脾气虚证大鼠模型，并以健脾中药反证，以期找寻一种稳定、可靠的脾气虚造模方法。

1 材料与方法

1．1 动物与分组：清洁级Wistar大鼠48只，由浙江中医药大学实验动物中心提供，雌雄各半，体重180±20g。动物随机分为对照组、模型组、中药组，各组16只。

1．2 药物与试剂：大黄制剂液：将生大黄饮片碎成粉，用蒸馏水浸泡，置于50℃水浴6h，去渣取汁。黄芪建中汤(黄芪、桂枝、生姜各9g，炙甘草6g，白芍18g，大枣12g，饴糖30g)水煎剂：常规煎煮，浓缩为含生药6kg／L。D―木糖试剂盒，南京建成生物工程研究所；胃泌素放免试剂盒，北京北方生物技术研究所；兔抗大鼠胃泌素抗，北京北方生物技术研究所；酶标记HRP二抗，美国DAKO公司；二氨基联苯胺(DAB)，北京中山生物技术公司。

1．3 主要仪器：SN-695型智能放免γ测量仪、LX-20型Beckman全自动生化分析仪、722型光栅分光光度计、石蜡包埋机、Leitz1512型组织切片机、OLYMPUS双目显微镜、LEICADMLB偏光摄像显微镜。

1．4 方法：对照组：每日上午以3ml／只灌服生理盐水，日1次，自由饮食。模型组与中药组：①每日上午以3ml／只灌服大黄制剂液，日1次；②每日下午将动物负重――于大鼠尾根部缠绕重量为该大鼠体重10％的保险丝，放入水深50cm、水温20℃的水槽中游泳，以力竭为度――大鼠鼻尖没入水面10秒，日1次。③控制饮食，每日上午8∶00给食，下午8∶00撤食。共21天。实验至第22天，各组随机取出大鼠8只，处理作相关检测，其余大鼠继续实验。自实验第23天起，对照组与模型组每日上午以3ml／只灌服生理盐水，日1次；中药组每日上午以3ml／只灌服黄芪建中汤水煎剂，日1次。自由饮食，共21天。实验至第45天，处理大鼠，作相关检测。

1．5 症状、体征观察：实验全程观测动物的体重，食量，粪便情况(腹泻、污秽、拉尾排便)，毛色，嗜睡，倦怠，乏力等情况。比较组间症状与体征的区别。

1．6 指标检测：全部大鼠眼球取血，分离血清，检测血清木糖浓度、血清肌酸磷酸激酶活性(CPK)、血清胃泌素(GAS)。动物解剖后，取胃窦部组织，以EnVision二步法检测G细胞。G细胞计数：光镜高倍视野(×400)对每张切片取胃窦部5个视野，读G阳性细胞数，并换算出每mm2面积内G细胞数。

1．7 统计方法：采用统计软件SPSS11．0处理数据，数值用均数±标准差(x±s)表示，采用方差分析。

2 结果

2．1 一般症状与体征：造模大鼠于第2、第3天开始泄泻，多为便溏；第6、第7天，出现食量减少；10天以后，出现成群蜷缩，扎堆，拱背，精神倦怠，嗜卧，四肢无力，反应迟钝，拉尾排便次数增多，同时毛发枯槁，甚至稀少；到18、19天，多数动物脱垂，明显消瘦。经黄芪建中汤治疗后，上述症状和体征逐渐消失。模型组大鼠未见明显好转。

2．2 血清木糖浓度、CPK、GAS、G细胞计数比较：造模21天后，造模大鼠与对照组比较，血清木糖浓度、CPK、GAS、G细胞计数下降，差异均有统计学意义(P

见表2。

2．3 胃粘膜病理改变：肉眼观察，对照组大鼠胃粘膜表面平整光滑，呈粉红色，有光泽，被覆较多粘液，粘膜皱襞规整，胃壁弹性良好。造模组大鼠胃粘膜颜色变浅，表面粘液少，可见粘膜水肿或糜烂，点状出血，个别出现大小不一的溃疡面。HE染色，经光镜观察，造模组大鼠胃粘膜薄、粘膜表面轻度糜烂，上皮坏死、脱落而不完，固有层及粘膜下层炎细胞浸润，红细胞数量明显增加，血管扩张充血；对照组胃粘膜结构清楚，上皮完整，可见绒毛和皱襞，炎细胞浸润较少，腺体完整且排列整齐。用药或生理盐水21天后，中药组恢复较好，而模型组的情况仍较差。

2．4 G细胞的分布、形态结构特点：免疫组化染色G细胞为深棕色，主要分布于胃窦粘膜腺体的中下1／3，或散布于粘膜上皮细胞之间，细胞分布不均匀，常单个或几个夹在腺细胞之间，对照片为阴性。细胞形态各异，呈圆、柱状、棱形或不规则，有的连续在一起形成团状。胞质内分泌免疫反应颗粒粗大，着色较深，为或棕黄色或淡棕色或棕褐色颗粒，有的细胞有突起，伸入到其它腺细胞之间，或基膜之间，或到腺腔。造模大鼠胃粘膜组织受，胃窦G细胞胞浆内分泌免疫反应颗粒细小，着色变浅，数量减少，甚至缺如。

3 讨论

3．1 脾气虚证造模方法：中医证候动物模型是中医动物实验中的核心问题，只有建立科学的中医证候动物模型，才能在中医理论指导下真正地开展中医动物实验研究。其中脾虚模型是脏腑虚证的代表模型之一，研究工作量居中医动物模型之首。郭氏

复杂的病因是中医临床证候的一大特点，本实验采用大黄泻下法、游泳力竭法和饥饿法复合，模拟中医传统病因来复制脾气虚证模型，是在中医理论的指导下从本质上对证候进行复制，并充分体现了中医致病因素的多重性。造模后，大鼠相继出现消瘦、大便溏泄、倦怠乏力、毛发不荣等脾气虚证的症状与体征，同时，造模大鼠血清木糖浓度、CPK等较为公认的客观指标均有明显改变。在造模因素撤去后，模型大鼠以上症状、体征仍存在，各项指

标未见明显改善，而中药组则得到了恢复。说明多因素复合复制的脾气虚证大鼠模型稳定性良好，克服了单因素造模方法持续时间短、自愈性强的缺点。该方法在思路和方法上符合中医基本理论，复制的动物模型出现相应证的证候，并经得起药物反证，符合脾虚动物模型造型的基本要求

3．2 GAS与G细胞：有关脾虚证与GAS的关系是近年来研究的热点，比较一致的看法是胃泌素与脾虚证的关系密切。但是，在这一研究方面，国内外大多局限于血清放免方面的研究，并且其结论各家的报道不一致，这可能与G细胞存在一定程度的代偿功能有关。有报道当胃窦粘膜发生进行性萎缩时，G细胞随之减少，并且随着萎缩程度的加重，G细胞脱颗粒增加，从而使GAS有一定程度的升高

4 参考文献

［1］郭书文，孟庆刚，王硕仁，等.中医动物模型研究存在的问题［J］.中国中医基础医学杂志，2001，7(2)：62-65.

［2］郑小伟.论脾虚动物模型的造型要求与思路［J］.中国中医药信息杂志，1999，6(9)：3-4.

［3］林静，薄爱华，姚希贤，等.胃泌素、生长抑素和5-羟色胺与慢性萎缩性胃炎病变关系的研究［J］.胃肠病学和肝病学杂志，1996，5(4)：270-275.

收稿日期 2007-11-26