益气活血化痰通络方干预Apo-E基因敲除小鼠动脉粥样硬化的实验研究

摘要 目的：观察益气活血化痰通络方对Apo―E基因敲除小鼠动脉粥样硬化(AS)进展的影响。方法：24次6周龄Apo―E基因敲除小鼠普通饲料喂养4周后随机处死6只，取主动脉根部HE染色后普通光镜下观察，确定AS斑决形成。余下18只10周龄Apo―E基因敲除小鼠分为中药组及对照组各9只，分别以益气活血化痰通络方及生理盐水灌胃14周后处死。HE染色观察AS斑块的大小和血管狭窄度。酶法分析测定血脂，双抗体夹心ELISA法进行检测血白介素―6(IL―6)。结果：6周龄Apo―E基因敲除小鼠普通饲料喂养4周后主动脉根部即出现AS病变，实验结束后HE染色显示中药组较对照组斑块面积减少；前者血管狭窄度较后者显著降低(P

关键词 炎症 动脉粥样硬化 益气活血化痰通络方 Apo―E基因 小鼠

动脉粥样硬化(AS)是不良心血管事件的主要原因之一，近来Ross在其提出的损伤反应学说的基础上明确提出：“动脉粥样硬化是一种炎症性疾病而不是单纯由于脂质沉积所致，炎症在动脉粥样硬化的各个时期都是突出的变化，而受累的动脉数量增多，可以导致全身性炎症活性增强，表现为血浆中的炎性标志物较多。”炎症是动脉粥样硬化发生、发展的中心环节，针对炎症机制有望寻找到控制动脉粥样硬化发生发展的更有效的治疗手段，有研究表明控制炎症可独立于局部的动脉粥样硬化负荷或缺血负荷之外而改善冠心病患者的预后。不稳定斑块富含炎症介质以及含剩余游离胆固醇巨噬细胞。游离胆固醇在巨噬细胞内的堆积可以导致炎症因子IL―6的分泌。本研究选用载脂蛋白E基因敲除小鼠为动脉粥样硬化模型，用益气活血化痰通络方对其进行干预，观察该方对动脉粥样硬化斑块的影响，并进一步探讨其机制，从而阐明其可能具有的临床效应，为指导合理的临床试验和可能的临床应用提供依据。

1、材料与方法

1.1 动物分组及取材：24只6周龄雄性Apo―E基冈敲除小鼠(C57BL/6，2005年3月购于北京大学医学部，生产批号：SCY―K京2002―0001，体重20±2g)，用普通饲料喂养4周，随机处死6只，取主动脉根部，HE染色，普通光镜下观察，确定动脉粥样硬化斑块形成。中药制剂：黄芪、茶树根各300g，丹参、当归、桑椹各150g，地龙、石菖蒲、泽泻各90g，3000ml清水煮沸后，水煎浓缩成300ml，每毫升含生药4.4g，置4℃冰箱保存备用，南岳阳医院制剂室提供。余下18只Apo―E基因敲除小鼠随机分为中药组(9只)和对照组(9只)，两组行普通饲料喂养的同时，中药组每天予益气活血化痰通络方0.4ml灌胃1次(按20ml/Kg/d)，对照组每天用生理盐水0.4ml灌胃1次(同前)，共14周。实验前(10周龄)全部小鼠眶后静脉取血0.3ml，1500rpm离心10分钟，离心半径5.5cm，取血清置-70℃冰箱待测。实验结束后重复采血，处理同前。14周后处死动物，各组动物用生理盐水及4％多聚甲醛灌注后取主动脉根部，自主动脉根部至腹主动脉末端离断整个主动脉。将小鼠主动脉近心端1cm切下，制备石蜡切片，每隔4um连续横切18张，每个切片上3个组织面，每间隔6张取1张，横切面的小鼠主动脉标本，行HE染色，×10倍镜下实域分割，分别选取所有斑块，体现分析斑块面积并计数，确定血管最狭窄处。×40倍镜下观察斑块的组织学特点并统计粥样斑块病变的面积以及比较血管狭窄度后进行分析。

1.2　指标检测：①总胆固醇和甘油三酯的测定：采用酶法分析，用分光光度仪测定样本的光密度值，根据标准液与待测样本光密度值之比值计算血脂水平。试剂盒购自上海名典生物工程有限公司；②血IL―6(白介素―6)检测：采用双抗体夹心ELISA法进行检测，采血后置于玻璃管中，随即于4℃离心10分钟(3000r/min)分离血清，置于-70℃冰箱待测。使用试剂由上海博光生物科技有限公司提供。

1.3 粥样斑块大小的分析：将包埋有小鼠主动脉根部的冰冻组织包埋剂O.C.T组织块置冰冻切片机上固定，参照Paigen法自心底向主动脉方向作厚10um的横断面切片，予HE染色，显微镜下观察。在病理组织实时摄像显微镜系统下采图，运用“多功能真彩色病理图像分析系统”软件分析各组织切片的斑块面积，统计血管狭窄度。

1.4　统计学分析：用SPSS10.0软件包建立数据库，组间比较用单因素方差分析进行统计，各指标用均数±标准差表示，P

2、结果

2.1 6周龄Apo―E基因敲除小鼠普通饲料喂养4周后主动脉根部AS斑块病变情况：小鼠标本HE染色主动脉根部已形成AS斑块。A为脂纹及大量泡沫细胞沉积，可见动脉粥样硬化病变；B为空泡及血管畸形与斑块形成。

2.2 实验前后血脂水平变化。小鼠实验前后血脂无显著变化。中药组和对照组经普通饮食饲养4周后分别予测定胆固醇和甘油三酯水平。无论10周龄还是24周龄，中药组和对照组之间，它们的胆同醇或甘油三酯水平，均无显著性差异，表明中药不影响Apo―E基因敲除小鼠的血脂水平。

2.3 实验前后血IL―6水平变化。实验结束后中药组血IL-6水平较实验前明显降低，经t检验证实给药前后二者差异有统计学意义(t=3.10，P

2.4 两组小鼠主动脉根部斑块及血管狭窄度比较：造模成功后，余下的18只小鼠随机分为中药组和对照组，分别灌胃中药和生理盐水，14周后，比较两组主动脉根部斑块面积和管腔狭窄度，结果显示中药组主动脉根部斑块面积较对照组明显缩小；对照组血管狭窄度明显增大，中药组血管狭窄度较对照组明显降低。两组实验结束后比较具有显著性差异(P

3、讨论

病理学研究及流行病学调查表明，动脉粥样硬化患者存在着不同程度的局部和全身炎症。致炎因子的刺激，内皮功能紊乱，脂质沉积，炎性细胞侵润，中膜平滑肌细胞活化，以及血小板活化、血栓形成等，是动脉粥样硬化的形成及发展要素，其中炎症贯穿于动脉粥样硬化全过程。祖国医学将动脉粥样硬化归属于“瘀血”、“症结”、“痰浊”等范畴。经曰“血之与气，异名同类”是也。人之一身，气血不能相离，气血相依，循环不息。

《景岳全书》云：“夫人之多痰，悉南中虚而然。”

故治痰须治本，使根本渐充，则痰将不治而自去矣。由此可知：正气亏虚，血行不畅，痰浊内生，瘀阻络脉可致动脉粥样硬化，根据中医理论，认为本病系元气虚衰，阴血亏损，筋脉失其濡养而导致阴阳失调，经络、血脉气虚，致使血瘀、痰阻而成本病。本病的成因是多种多样的，但总离不开虚(元气不足)、瘀(瘀血)、痰(痰浊)三字。故可把动脉硬化的病理机制归纳为：“气血亏损，痰浊、瘀血互结，胶着脉管”而成病，亦即本虚标实，痰瘀致病。对于本病有效的治疗，非补气补血，即活血、化痰、通络。而活、化、通皆有消散之意，主要的目的在于治标，这是不容忽视的一环。

补消共施是治疗的根本大法，因此，根据动脉硬化的基本病机，笔者提出益气、活血、化痰、通络的原则，用于抗动脉粥样硬化的研究。方中黄芪补一身之气，当归、丹参养血活血，桑椹滋养阴血，据研究有抑制低密度脂蛋白(LDL)氧化的作用；地龙攻窜通络，石菖蒲、泽泻化痰泄浊，茶树根清热消瘀，合之共奏益气活血、化痰通络之效。该方在临床用于抗动脉粥样硬化的研究中已证明有较好疗效，本研究进一步证明，其机制可能为通过抑制炎症因子的水平而起到疗效。同类研究如杨五彪等研究发现，黄芪多糖可以使AS家兔的CRP明显降低，说明黄芪多糖具有抗炎症反应、免疫调节之功效，对AS有明显的预防和治疗作用。可见，益气活血化痰通络方很可能通过其显著的抗炎作用而抑制动脉粥样硬化。动物实验可在良好控制和平衡其它影响因素的情况下，明确抗炎干预所产生的局部病理学变化，并进而分析这种变化与全身循环血液学指标的关系。有研究表明，通过观察6种常用活血中药(赤芍、丹参、川芎、三七、桃仁和制大黄)对ApoE基因缺陷小鼠动脉粥样硬化斑块炎症反应和血脂的影响，以中药组和对照组(辛伐他汀)相比，上述活血中药能够干预Apo-E基因缺陷小鼠成熟斑块的进展，有一定稳定斑块的作用，其机制可能与调节脂质代谢和抑制炎症反应有关，不同活血药在常规剂量下，其作用环节和强度上可能存在差异。

Apo―E基因敲除小鼠动脉粥样硬化各阶段的病理表现均存在于该模型中，且小鼠的基因组与人类极为接近，因此本研究选用Apo―E基因敲除小鼠为动脉粥样硬化模型。主动脉根部是动物实验分析早期动脉粥样硬化的经典部位，本研究选用的益气活血化痰通络方，根据能达充分效应的临床剂量换算后应用于10周龄Apo―E基因敲除小鼠，结果显示，在给药14周之后，中药组主动脉根部的动脉粥样硬化斑块面积较对照组明显减少，血管狭窄度亦明显降低。此外，14周后两组之间的血脂水平并无显著性差异，即中药组是在不影响血脂的情况下产生的抑制动脉粥样硬化的作用，说明其机制与调脂无关。

总之，本研究结果表明，用益气活血化痰通络方可以抑制动脉粥样硬化的进展，而且所用中药的浓度、用药剂量及足够的疗程亦很重要。但是，还需要继续开展设计合理的临床试验，进一步证实其有效性和安全性。