艾炷灸对D―半乳糖衰老小鼠脑组织NO、NOS的影响

摘要 目的：探讨艾炷灸抗衰老作用机制。方法：连续42天颈背部皮下注射D―半乳糖造成小鼠衰老模型；观察艾炷灸小鼠脑皮层NO(一氧化氮)含量、NOS(一氧化氮合酶)活力的影响。结果：①D―半乳糖致衰老小鼠和18月龄自然衰老的小鼠其脑组织NO含量和NOS活力都呈增高的趋势。②艾炷灸治疗组与生理盐水对照组小鼠脑组织NO含量和NOS活力水平较模型组和自然衰老组低，并有显著差异。结论：艾炷灸足三里、悬钟可以降低D―半乳糖致衰老小鼠脑组织NO含量和NOS活力，从而抑制了增高的NO产生的细胞毒性，起到延缓衰老的作用。

关键词 抗衰老 艾炷灸　D―半乳糖 NO NOS

NO在中枢神经系统(CNS)中一种重要的生物信使分子，其分布很广泛，几乎没有脑区缺乏。NO在CNS中具有双重作用，既有神经保护作用，也有神经毒性作用。NOS是NO产生的关键酶，可催化L―精氨酸形成NO，NOS存在于胞内可溶性部分，在体内主要有三种类型：神经元型(nNOS)、诱导型(iNOS)和内皮型(eNOS)。NOS的表达不是一成不变的，随着年龄增长，各种类型NOS表达水平会发生相应变化，NOS活性升高，增龄细胞中的NO生成也相应增多，从而改变了胞内NO水平。本研究通过D―半乳糖注射建立小鼠衰老模型，以脑组织NO含量和NOS活力为观察指标，探讨艾炷灸疗法对脑衰老变化情况的影响机制。

1、实验材料与方法

1.1 实验动物：健康3月龄昆明雌性小鼠体重30±2克33只，15月龄自然衰老小鼠10只，由广西中医学院动物中心提供。

1.2　主要试剂和仪器：D―半乳糖为上海试剂二厂生产，批号：20030406；生理盐水；NO试剂盒、NOS试剂盒、考马斯亮兰蛋白测定试剂盒(由南京建成公司提供)；SVNRISE型酶标仪，AUSTRIA制造；HH-8数显恒温水浴锅；液体快速混合器；JY92―ⅡD超声波细胞破碎机；Biofuge Stutos型高速低温离心机。

1.3　方法：33只小鼠编号后，按随机数字表，随机分为3组，即模型组、模型+艾炷灸治疗组、生理盐水对照组，每组11只(生理盐水对照组死亡1只)。参照文献将D―半乳糖与生理盐水按1.2(g)：100(ml)混匀为12mg/ml，艾炷灸治疗组和造模组每天以D―半乳糖按120mg/kg/d颈背部皮下注射(相当于每10g重量注射0.1ml浓度为1.2％的D―半乳糖溶液)，连续42天，同时生理盐水对照组颈背部皮下注射等量的生理盐水42天；艾炷灸治疗组在注射12天后开始艾炷灸治疗，时间选择上午9：00～11：30，选取小鼠双侧“足三里”(先灸)、“悬钟”(后灸)，隔天治疗1次，每穴3壮，共12壮。定位取穴按照林文注编《实验针灸学》和胡元亮编《实验动物针灸手册》，“足三里”在膝关节下方，腓骨小头下3mm处的肌沟中；“悬钟”在后肢外踝尖直上5mm腓骨后缘处。穴位选定后剪毛，施灸时涂凡士林以保护小鼠皮肤且便于固定艾炷，用米粒大艾炷(重为30mg)施灸，艾炷做得紧而结实，用线香点燃，当小鼠挣扎时(以局部红晕或潮红为度)更换艾炷。造模组及生理盐水组在12天后隔天进行同样时间同样程度的刺激。另将自衰组(比其他三组提前饲养45天)在同等饲养条件下饲养。治疗满30天后，将所有小鼠断头处死，立即取出大、小脑皮质匀浆、离心。NO含量的测定采用硝酸还原酶法，NOS测定用化学比色法，按试剂盒说明书要求测各项指标。(NO单位含量定义为每克蛋白中含有的微摩尔量；NOS活力单位定义：每毫升组织每分钟生成1nmol NO为一个酶活力单位。)数据统计应用SPSS13.0软件计算，各组数据以均数±标准差(x±s)表示，组间均数比较采用单因素方差分析检验。

2、结果

2.1 小鼠衰老模型脑组织NO含量变化：如表1所示，4组小鼠的大、小脑皮质NO含量具有显著性差异，其中：造模组大、小脑皮质NO含量与生理盐水对照组相比具有显著性差别(P0.05)，而小脑皮质NO含量明显高于自然衰老对照组(造模组与自然衰老对照组在大、小脑皮质中NO含量都明显升高，而自然衰老对照组小脑皮质NO含量升高不如造模组明显)，提示D―半乳糖所致的亚急性衰老小鼠脑内NO含量变化情况接近自然衰老小鼠；模型+艾炷灸治疗组大、小脑皮质NO含量与生理盐水组相比较无显著性差别(P>0.05)；与模型组、自然衰老对照组相比NO含量处于较低水平(P

2.2 小鼠衰老模型脑组织NOS活力变化：如表2所示，4组小鼠的大、小脑皮质NOS活力具有显著性差异，其中造模组与自然衰老对照组的大、小脑皮质NOS活力均增高，两者相比较均有非常显著性差别(P

3、讨论

D―半乳糖衰老模型是目前较多用的一种人工催老模型，具有衰老变化明显、模型稳定、耗时短等特点。D―半乳糖造成衰老模型是因代谢过程中机体产生大量自由基，其表现为多种抗氧化酶活性下降，引起小鼠的脑老化效应，并在多种器官、组织的形态及生理、生化的许多观测指标上，均呈现出与自然衰老相似的改变。本研究也证明：D―半乳糖致衰老小鼠和18月龄自然衰老的小鼠其大、小脑皮质中NO含量、NOS活力水平接近。

一氧化氮(NO)具有广泛的生物学作用，参与调节神经系统、心血管系统及呼吸消化系统的功能和介导免疫应答等诸多生理和病理过程，是体内重要的信使分子和神经递质，与脑部学习及记忆密切相关；同时又是一种极不稳定的强氧化剂，过量的NO则会作为强氧化剂与超氧阴离子发生反应，产生细胞毒性更强的过氧化硝基基团，对细胞产生毒性从而导致衰老的发生。NOS是NO产生的关键酶，NOS可催化L―精氨酸形成NO。增龄细胞中的NO生成也相应增多，这主要由于NOS活性升高所致。

祖国医学认为，脑为元神之府，总统诸神，主思维、记忆、主聪慧。随着年老髓海不足，则会出现记忆力减退，头晕、耳鸣等症。王清任《医林改错・脑髓说》曰：“灵机记性不在心在脑，……所以小儿无记性者，脑髓未满，高年无记性者，脑髓渐空。”《灵枢・海论》云：“髓海有余则轻劲多力，自过其度；髓海不足则脑转耳鸣，胫酸眩冒，目无所见，懈怠安卧。”四海理论认为，十二经脉皆归于四海，强调水谷、气、血、脑髓在人体的重要作用，气血之精华皆上聚于髓海，可知经络腧穴对髓海有重要的调节作用。足三里为胃经的合穴，胃为气血化生之源，其经多气多血；悬钟是足少阳胆经穴，亦是八会穴中的髓会，胆经之穴主骨所生病，又生髓之功，二穴施灸具有激发经气、补益气血、益精添髓、强壮机体的作用，为防病和抗衰老的重要穴位，故《外台秘要》言：“三里养先后天之气，灸三里可使元气不衰”遂有“保健灸穴”和“长寿灸穴”之美称。《针灸大成・治症总要第六》用此二穴防治中风，有“半身不遂、中风：绝骨、昆仓、足三里……”在预防中风时主张：“便宜急灸三里、绝骨四处，各三壮”。现代研究也证实了艾灸足三里、悬钟等穴，具有清除自由基，提高免疫力，延缓神经衰老，系统老化，调节血压、血脂，预防中风等作用。

艾灸不仅可以延年益寿而且可以未病先防，有病早治。古代艾灸疗法以艾炷灸最为盛行，特别是有关研究证实，艾灸的燃烧生成物具有抗氧化作用，为本研究中艾炷灸疗法对抗自由基的作用提供有力的佐证。本研究观察到D―半乳糖致衰老小鼠和18月龄自然衰老的小鼠其脑组织NO含量和NOS活力都呈增高的趋势，表明衰老引起的髓海不足与自由基代谢紊乱有关，而通过艾炷灸足三里、悬钟可以降低D―半乳糖致衰老小鼠脑组织NO含量和NOS活力，从而抑制了增高的NO产生的细胞毒性，为艾炷灸足三里悬钟延缓衰老的机制提供客观依据。