强化阿托伐他汀对不稳定型心绞痛患者PCI围术期CD4+T淋巴细胞 Sprouty1表达的影响

DOI：10.3760/cma.j.issn.1671-0282.2013.08.021

基金项目：国家自然科学基金资助项目（81160046）

作者单位：530021南宁，广西医科大学第一附属医院心内科广西心血管病研究所

通信作者：李浪，Email：

【摘要】目的探讨强化剂量他托伐他汀对不稳定心绞痛患者PCI围术期CD4+T淋巴细胞Sprouty1表达的影响。方法入选广西医科大学第一附属医院住院不稳定型心绞痛患者52例，随机（随机数字法）分为强化他汀组（术前80 mg/d，术后40 mg/d，n=26）和常规他汀组（术前术后均20 mg/d，n=26）。分别于PCI术前、术后16～24 h抽取新鲜外周血，免疫磁珠法分选出CD4+T淋巴细胞，荧光定量PCR检测Sprouty1mRNA表达，蛋白免疫印迹法检测Sprouty1蛋白表达，酶联免疫法检测IL-2炎症因子的表达。结果①与PCI术前强化组相比，PCI术后强化组Sprouty1mRNA、Sprouty1蛋白表达明显升高（P0.05）③与PCI术前强化组相比，术后强化组IL-2浓度降低（P0.05）。结论强化剂量的阿托伐他汀可以通过上调CD4+T淋巴细胞Sprouty1的表达，从而减少PCI术后心肌的炎症反应。

【关键词】不稳定型心绞痛；阿托伐他汀；CD4+T淋巴细胞；Sprouty1；IL-2

Effects of large dose of atorvastatin on the expression of Sprouty-1 in CD4+T lymphocytes from unstable angina patients during perioperative period of PCI WEN Wei-ming，SU Qiang，WANG Jiang-you，ZHOU You，LIU Yang，LU Yong-guang，LI Lang. Department of Cardiology，The First Affiliated Hospital of Guangxi Medical University，Nanning 530021，China.

Corresponding author：LI Lang，Email：

【Abstract】ObjectiveTo investigate the effects of large dose of atorvastatin on the expression of Sprouty-1 in CD4+T lymphocytes from unstable angina patients during perioperative period of PCI.MethodsA total of 52 unstable angina patients enrolled were divided randomly（random number） into large-dose atorvastatin （80 mg/d， n=26） pretreated group and moderate-dose atorvastatin （20 mg/d， n=26） pretreated group. Circulating CD4+T cells were obtained by magnetic cell sorting system （MACS） before PCI and 18-24h after PCI. For detecting the gene expression， the reverse transcription fluorescent quantitative polymerase chain reaction （RT-PCR） was used to measure the expression of Sprouty-1 mRNA in CD4+ T lymphocyte. The level of Sprouty-1 protein was detected with Western blot analysis and IL-2 was quantified by enzyme-linked immunosorbent assay （ELISA）. Results①Compared with large-dose group before PCI，the expression of Sprouty-1 mRNA and Sprouty-1 protein levels were dramatically increased in large-dose group after PCI （P0.05）. ③Compared with large-dose group before PCI，the serum level of IL-2 was decreased in large-dose group after PCI （P0.05）. ConclusionsLarge-dose atorvastatin pretreatment reduced post-PCI myocardial inflammation through up-regulating the expression of Sprouty-1 mRNA and level of Sprouty-1 protein in CD4+T lymphocytes.

【Key words】Unstable angina； Atorvastatin； CD4+T lymphocytes； Sprouty1， IL-2

经皮冠状动脉介入治疗（percutaneous coronary intervention，PCI）术中及术后的病死率和紧急冠脉搭桥术逐渐减少，但术后心肌损伤（periprocedural myocardial Injury，PMI）仍是临床常见而棘手的并发症，是患者近期和远期预后不良的独立预测因子，临床上缺乏有效的防治方法[1]。 既往研究发现，不稳定性心绞痛（unstable angina pectoris，UAP）急性反应期可激活CD4+T淋巴细胞，并致使IL-2、IFN-γ等炎症因子的分泌增加，参与了不稳定性斑块的发生、发展过程[2]。PCI术可诱发或促进不稳定斑块破裂，不但激活局部的T淋巴细胞，还可以导致外周血淋巴细胞的显著激活和氧化应激产物标志物的显著增高，促进心肌局部炎症的发生发展[3]。Sprouty最早作为在果蝇的支气管分化中成纤维细胞生长因子的拮抗剂而被发现[4]。近年发现Sprouty1参与负性调控淋巴细胞的增殖和分化，过表达 Sprouty1能抑制CD4+T淋巴细胞的分化与激活，并减少IL-2等炎症因子的分泌[5]。因此，可推测Sprouty1参与了炎症反应的过程，并起到负调控炎症反应的作用。

ARMYDA多项研究表明，PCI术前2 d给予80 mg大剂量的阿托伐他汀，能有效降低炎症指标CRP水平，明显减少术后心肌损伤的发生率，30 d主要不良心脏事件危险降低88%[6-7]，推测该效益可能归因于阿托伐他汀抗炎作用。目前虽然他汀类药物在PCI术后心肌损伤中的作用机制尚未完全阐明，但术后心肌CD4+T淋巴细胞被激活，诱发心肌炎症反应是明确的[8]，然而他汀类药物可以抑制心肌炎症反应。因此，本研究观察强化他汀对不稳定心绞痛患者PCI围术期CD4+T淋巴细胞Sprouty1表达的影响，以探讨他汀预防PCI术后心肌损伤作用机制，为PCI术后心肌损伤的临床防治提供理论依据。

1资料与方法

1.1一般资料

选取2011年10月至2012年4月入住广西医科大学第一附属医院并行择期PCI的UAP患者52例（男45例，女7例），年龄（62.39±9.41）岁，随机（随机数字法）分为强化他汀组（术前2 d给予80mg/d， 术后给予40 mg/d，n=26）和常规他汀组（术前术后均为20 mg/d，n=26）两组均为术前2 d首次服用阿托伐他汀。UAP患者均经冠脉照影证实存在冠状动脉狭窄，有行PCI指征，且心肌酶学标记物CK-MB和CTnI阴性，无他汀应用禁忌证，初发心绞痛、劳累恶化性心绞痛和静息性心绞痛。排除：①合并严重感染或肿瘤患者；②严重肝肾功能不全者；③他汀类药物过敏者；④脑卒中；⑤左室射血分数

1.2采集标本

UAP组冠脉造影证实具有冠脉病变并需要置入支架的患者分别采集PCI前，术后18～24 h新鲜外周静脉血20 ml。对照组入选后于次日早上用采集新鲜外周静脉血20 ml。20 ml中取1 ml血自然凝固20 min后，2000 r/min离心10 min，收集血清用于ELISA检测IL-2。余下用肝素抗凝后分离细胞。本实验遵照广西医科大学伦理委员会人体试验管理规范执行。所有的病例选择和标本提取均获患者知情同意并签署同意书。

1.3材料

人淋巴细胞分离液（索莱宝，中国），Dynabeads FlowCompTM Human CD4试剂盒（Dynal，挪威），RPMI1640培养基（Hyclone，USA），TRNzol-A+总RNA提取试剂（天根，中国）RevertAidTM FistStrand cDNA Synthesis kit（Fermentas，立陶宛），Fase Start Universal SYBR Green Master（Rox，USA）， Sprouty1mRNA、GAPDHmRNA引物（生工，中国），兔抗人Sprouty1单抗（santa cruz ，USA），羊抗兔荧光二抗（LI-COR，USA），GAPDH单抗（碧云天，中国），荧光二抗（KPL，USA），蛋白Marker（Fermentas，立陶宛），Human TNF-alpha Platinum ELISA和Human IL-2 Platinum ELISA（ebioscience，USA）， Step-one 荧光定量基因扩增仪（ABI、美国），Odessay双色红外激光成像系统扫描仪。

1.4细胞提取

根据Ficoll-Paque密度梯度离心法提取三组患者和健康志愿者PBMC细胞，重悬于1 ml 1640培养基，取10 μl PBMC重悬细胞加90 μl PBS稀释10倍后作细胞计数，余下细胞严格按照Dynabeads FlowCompTM Human CD4磁珠分选试剂盒说明书操作分选CD4+T淋巴细胞。分选出的细胞同样做细胞计数，同时用0.4%台盼蓝染色观察并计算出活细胞存活率，存活率>90%的CD4+T淋巴细胞留下备用。

1.5荧光定量PCR检测Sprouty1mRNA表达量

按照 Trizol操作说明提取细胞的总RNA， 并用Nanodrop测量其浓度，同时用1%琼脂糖凝胶电泳检测RNA有无降解，调整 RNA 的量为 1 μg/μl ，逆转录合成cDNA。采用SYBR GreenΙ荧光标记法检测PCR 产物，总反应体系为20 μl ，Sprouty1引物：上游：5’-TTCCCTCCTTCCCCTGTTGCCA-3’下游：5’- CCAGGTGCAGCTTCCCAGTCC-3’；GAPDH引物：上游：5’-GAGTCAACGGATTTGGTCGT-3’下游：5’- GACAAGCTTCCCGTTCTCAG-3’，按试剂盒说明设置反应体系及参数，每个样本均做复孔检测，同时每次反应均设置阴性孔。PCR产物经过测序检测。结果采用2-ΔΔCT法比较。

1.6Western blot 检测Sprouty1蛋白的表达

分选出的CD4+T淋巴细胞中加入100 μl 蛋白裂解液混匀，然后在4 ℃下12 000 r/min离心20 min，提取上清转移至新离心管中，然后用BCA法检测蛋白浓度，内参为GAPDH。配置12%分离胶和5%浓缩胶，进行SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝胶电泳，半干法转膜40 min，用TBST配置的5%脱脂奶粉封闭1 h，1∶2500一抗4 ℃敷育过夜，脱色摇床上用TBST洗膜5 min×5次，1∶5000红外荧光二抗室温敷育2 h后在双色红外激光成像系统扫描成像。

1.7ELISA 检测IL-2质量浓度

将收集的血清标本及培养基上清和ELISA试剂盒常温下放置约30 min，操作步骤按说明书进行。

1.8统计学方法

采用SPSS 13.0统计软件对实验数据进行分析，计量资料以均数±标准差（x±s）表示，两组间比较采用成组t检验，多组间比较采用方差分析（ANOVA分析），计数资料以频数及构成比表示，采用χ2检验。以P

2.1患者一般资料比较

强化他汀组与常规他汀组在年龄、性别、吸烟史、糖尿病史、血脂异常、高血压、既往心血管病病史、药物治疗等方面差异无统计学意义（P>0.05），见表1。强化组和常规组在冠脉病变部位、狭窄程度、数量及支架植入数等差异均无统计学意义（P>0.05），见表2。表1各组临床资料比较（例，%）

Table 1Clinical characteristics of each group（n，%）

①术前强化组与常规组之间Sprouty1mRNA表达差异无统计学意义（P>0.05）；②与PCI术前强化组相比，PCI术后16～24 h强化组Sprouty1mRNA表达明显升高（P0.05），见图1。

与PCI术前强化组比较，aP

图1Sprouty1 mRNA表达量比较

Fig 1RFQ-PCR for mRNA expression of Sprouty12.3Western blot 检测各组Sprouty1 蛋白的表达

Western blot定量分析显示：①术前强化组与常规组之间Sprouty1相对蛋白表达量差异无统计学意义（P>0.05）；②与PCI术前强化组相比，PCI术后强化组Sprouty1相对蛋白表达量明显升高（P0.05）。见图2。

2.4ELISA检测血清IL-2炎症因子的质量浓度

①PCI术前强化组（24.91±2.24 ）pg/ml与常规组（25.01±2.40 ）pg/ml之间血清IL-2质量浓度差异无统计学意义（P>0.05）；②与PCI术前强化组相比，术后强化组IL-2（19.65±2.12 ）pg/ml质量浓度降低（P0.05）。

3讨论

PCI术后心肌损伤是择期PCI术常见的并发症，尤其常见于高危急性冠脉综合征，发生率达30%～70%，主要表现为PCI术后心肌损伤标记物升高，患者常无症状，不伴有心电图或超声心动图的改变，在临床上极其容易忽视[9]。既往研究表明：患者一旦发生术后心肌损伤，则近远期心脏不

与PCI术前强化组比较，aP

图2各组Sprouty1蛋白表达量比较

Fig 2Western blot analysis Sprouty1protein expression of each group良事件显著增高、预后不良[10]。 既往研究发现，不稳定性心绞痛（unstable angina pectoris，UAP）急性反应期可激活CD4+T淋巴细胞，并致使IL-2、IFN-γ等炎症因子的分泌增加，参与了不稳定性斑块的发生、发展过程[2]，而PCI术更是进一步加重CD4+T淋巴细胞介导的炎症反应[11]。Sprouty最早作为在果蝇的支气管分化中成纤维细胞生长因子的拮抗剂而被发现[4]。 Sprouty1既往发现主要参与细胞的增殖与分化，抑制血管生长[12]。近年来研究发现Sprouty1也参与了炎症反应，并起到负调控炎症反应。Choi等[13]研究报道Sprouty1能通过负调控T细胞抗原受体（T cell receptor ，TCR）信号介导促分裂素原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinases，MAPK）的活化，影响T细胞的分化及激活，导致IL-2分泌减少；抑制Sprouty1表达，则IL-2分泌增强。Urs等[14]研究显示在脂肪组织中，Sprouty1可以通过抑制脂肪组织介导的血管新生，减少巨噬细胞，T淋巴细胞的渗出，减少炎症反应。既上调Sprouty1的表达，可以减少IL-2分泌，抑制炎症反应。

ARMYDA系列研究发现，PCI术前给予大剂量的阿托伐他汀，能够有效地降低炎症因子水平及减少术后心肌损伤的发生率，明显改善患者近期预后[6]。多项研究表明，他汀类药物能直接抑制T淋巴细胞的激活，进而抑制炎症的发展[15-16]。Kwak等[17]研究发现他汀类药物可以明显降低内皮细胞和单核巨噬细胞MHCⅡ的表达，从而抑制T淋巴细胞的增殖和IL-2的释放。IL-2又名T细胞生长因子（T cell growth factor，TCGF），主要由活化的CD4+T细胞和CD8+T细胞产生的具有广泛生物活性的细胞因子[18]。IL-2是一种重要的炎症因子，参与不稳定性斑块的发生、发展过程，在促使斑块破裂及炎症损伤中起到重要的作用[19]。

PCI术前2 d给予80 mg大剂量的阿托伐他汀，可以上调Sprouty1蛋白表达，降低血清IL-2质量浓度。而常规剂量组Sprouty1蛋白表达上调不明显，血清IL-2质量浓度表现出升高趋势，可能与PCI术刺激炎症的加强有关。强化他汀减少术后心肌损伤，可能通过上调CD4+T淋巴细胞Sprouty1的表达，进而降低IL-2质量浓度起效.强化他汀能减少术后心肌损伤机制，与上调CD4+T淋巴细胞Sprouty1的表达，降低PCI术后的炎症反应有关。在人T细胞中Sprouty1基因经TCR信号刺激作用后表达上调，随后又负反馈调控TCR信号通路，减少IL-2的分泌[5]。此外，一些物理因素也可以对Sprouty1进行调控，例如，Huebert等[20]发现心脏受机械负荷刺激降低可导致Sprouty1上调，并伴随ERK1/2磷酸化程度降低，改善机械非负荷性刺激所致的心肌面积增大。在分子生物学水平上，微小核糖核酸-21（miRNA-21）对于Sprouty1表达的调控是目前研究的热点。microRNA-21可通过和sprouty-mRNA碱基配对引导RNA诱导的沉默复合体降解sprouty-mRNA或阻碍其翻译[21]。

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（收稿日期：2013-03-22）