棉花遗传转化过程中外植体对卡那霉素敏感性的研究

摘要：文章研究了以下胚轴为转化的外植体材料，根癌农杆菌介导的棉花遗传转化过程中，下胚轴、胚性愈伤组织（EC）、体细胞胚胎（胚状体）三种外植体不同的生长阶段，对卡那霉素（Kan）的敏感性差异。结果表明：体细胞胚胎（胚状体）对卡那霉素（Kan）最为敏感，下胚轴次之，胚性愈伤组织（EC）则最不敏感。

关键词：棉花；下胚轴；农杆菌；胚性愈伤组织（EC）；胚状体

中图分类号：Q946 文献标识码：A 文章编号：1674-0432（2011）-04-0061-2

0 引言

在对棉花进行遗传转化之前，最重要的就是先要针对所选用的外植体材料不同，来选定一个合适的抗生素（一般选用卡那霉素）筛选浓度，这是外源基因转化成功的一个很关键的因素。而在对被转化过的外植体进行培养时，也有必要根据外植体生长的不同阶段对抗生素的敏感性差异，适当的调节培养基中的筛选抗生素浓度，这样才能在最大限度上筛选得到再生阳性植株。

1 材料和方法

1.1 材料

棉花品种为“珂字棉312”，由上海交通大学农业与生物学院左开井博士提供。

1.2 主要培养基如下

G1培养基：MS+葡萄糖（3%）+结冷胶(Gellan Gum)（0.3%）+ IAA、KT、2,4-D各0.1mg/L +羧苄青霉素(Cab) 500mg/L+卡那霉素(Kan), PH=6.3-6.5；

G2培养基：MS+葡萄糖（3%）+结冷胶(Gellan Gum)（0.3%）+6-BA 0.15mg/L +KT 0.15mg/L +头孢青霉素(Cef) 500mg/L +卡那霉素(Kan), PH=6.3-6.5；

G3培养基：MS+葡萄糖（3%）+结冷胶(Gellan Gum)（0.3%）+6-BA 0.15mg/L +KT 0.15mg/L +谷氨酰胺0.5g/L+天门冬酰胺0.5g/L+头孢青霉素(Cef) 500mg/L+卡那霉素(Kan), PH=6.3-6.5；

1.3 方法

棉花下胚轴、胚性愈伤组织（EC）、体细胞胚胎（胚状体）获得的具体方法参照商海红（2009）和Ganesan Sunilkumar and Keerti S.Rathore（2001）。

1.3.1 下胚轴对卡那霉素（Kan）的敏感性 将卡那霉素（Kan）浓度设为0、10、25、50、75、100和125mg/L 7个梯度。选择生长状态相当的下胚轴切段，分别接种到含有以上7个不同Kan浓度的7种G1培养基上生长。每隔3周左右对培养基继代一次。约2个月后，分别统计各培养基上下胚轴的出愈率情况，并记录。

1.3.2 胚性愈伤组织（EC）对卡那霉素（Kan）的敏感性 选取一定数量的生长状况相同的胚性愈伤组织，将其分为7份，对每一份的胚性愈伤组织块进行称重，并记录。然后分别接种在卡那霉素（Kan）浓度为0、10、25、50、75、100和125mg/L的7种G2培养基上，每隔3周左右对培养基继代一次。分别在7周、10周和13周后，对每一个培养基上的胚性愈伤组织进行称重，并记录。

1.3.3 体细胞胚胎（胚状体）对卡那霉素（Kan）的敏感性 选取一定数量的生长状况相同的体细胞胚胎（胚状体），将其分为7份，记录每一份的胚状体数量。然后分别接种在卡那霉素（Kan）浓度为0、5、10、15、20、25、30、40、50和60mg/L的10种G3培养基上，每隔3周左右对培养基继代一次。分别在6周、12周和15周后，对每一个培养基上的胚状体数量进行记录。

2 结果

2.1 下胚轴对卡那霉素（kan）的敏感性变化曲线

图1 棉花下胚轴对卡那霉素（Kan）的敏感性

Fig.1 Sensibility of explants to the concentration of Kanamycin（Kan）

棉花下胚轴本身对卡那霉素（Kan）就具有一定的抗性，随着卡那霉素（Kan）浓度的提高，这种抗性也逐渐降低，主要表现在下胚轴出愈率也逐渐降低（见图1）。当Kan浓度分别为50mg/L和75mg/L时，二者出愈率差异很小，分别为21.8%和19.84%，当浓度大于75mg/L时出愈率急剧下降，在浓度达100mg/L和125mg/L时，出愈率仅为5.42%和2.27%。综合来看，下胚轴对卡那霉素（Kan）的浓度变化并不是十分敏感。如果以下胚轴作为遗传转化的外植体材料时，卡那霉素（Kan）的筛选浓度应选择50或75mg/L为最佳。

2.2 胚性愈伤组织（EC）对卡那霉素（kan）的敏感性变化曲线

图2 胚性愈伤组织（EC）对卡那霉素（Kan）的敏感性

Fig.2 Sensibility of embryogenic callus to the concentration of Kanamycin（Kan）

当卡那霉素（Kan）的浓度在0-75mg/L的范围内变化时，胚性愈伤组织（EC）的重量在13周的时间内均是不断增加的，即在不断的生长过程中，这说明Kan对胚性愈伤组织生长的抑制作用很弱，或者没有抑制其生长（见图2）。但当Kan浓度提高到100mg/L时，胚性愈伤组织几乎没有生长，甚至在从10周开始，一部分的胚性愈伤组织已经死亡，这表明100mg/L的Kan已经在很大程度上抑制了胚性愈伤组织的生长。当Kan浓度提高到125mg/L时，大量的胚性愈伤组织褐变死亡。综合来看，胚性愈伤组织对卡那霉素（Kan）的浓度变化极不敏感。如果以胚性愈伤组织作为遗传转化的外植体材料时，卡那霉素（Kan）的筛选浓度应选择100mg/L。

2.3 体细胞胚胎（胚状体）对卡那霉素（kan）的敏感性变化曲线

图3 体细胞胚胎（胚状体）对卡那霉素（Kan）的敏感性

Fig.3 Sensibility of embryoid to the concentration of Kanamycin（Kan）

当卡那霉素（Kan）的浓度在低于5mg/L时，胚状体的数量几乎没有发生改变，即这个浓度范围内的Kan对其生长没有影响（见图3）。当Kan的浓度在10-20mg/L的范围内时，有小部分的胚状体开始死亡，但15周后，绝大多数的胚状体生长状况良好。当Kan的浓度超过25mg/L时，6周、12周和15周后，大量的胚状体都死亡。当其浓度达到60mg/L时，15周后全部的胚状体均死亡。这表明，当Kan的浓度达到25mg/L时，胚状体的生长就开始受到了极大的抑制作用，同时也表明了胚状体对卡那霉素（Kan）的浓度变化极为敏感，因此在诱导胚状体生长的G3培养基中最好加入低浓度的Kan，Kan浓度过高则及容易影响胚状体的生长，应选择10-20mg/L的Kan为最佳。

3 讨论与小结

在根癌农杆菌介导的棉花遗传转化中，作为筛选抗生素，理论上认为，卡那霉素（Kan）浓度越高，越能抑制外植体的生长，便越有利于最终筛选出所需要的阳性转基因植株，而且也可以在很大程度上减少遗传转化后期筛选阳性转基因植株的工作量。但是卡那霉素（Kan）浓度过高反而不利于棉花外植体再生成苗，因此，以下胚轴作为遗传转化的外植体材料时，卡那霉素（Kan）的筛选浓度应选择50或75mg/L为最佳。这与李燕娥等（2000）所建立的棉花农杆菌介导高效转化体系中所使用的卡那霉素（Kan）筛选浓度70 mg/L比较吻合，而李俊兰等（2002）在研究中则提出了采用25或50mg/L作为筛选浓度；以胚性愈伤组织作为遗传转化的外植体材料时，卡那霉素（Kan）的筛选浓度应选择100 mg/L；胚状体对卡那霉素（Kan）的浓度变化极为敏感，在诱导其生长的培养基中最好加入低浓度的Kan，应选择10-20mg/L的Kan为最佳。这样既能保证在最大程度上筛选出阳性转基因植株，又能避免高浓度的抗生素抑制再生苗的生长。

作者简介：孙英坤（1985-），男，山东烟台人，西南科技大学生命科学与工程学院08级研究生，研究方向：植物遗传。

通讯作者：王劲（1968-），女，四川人，任职于西南科技大学生命科学与工程学院和中国农业科学院生物技术研究所，西南科技大学教授，博士、硕士生导师，研究方向：植物分子生物学。