RP―HPLC测定救必应药材中紫丁香苷的含量

[摘要] 目的 建立反相高效液相色谱法 （RP-HPLC）测定救必应药材中有效成分紫丁香苷的方法。 方法 采用Aglient 5HC-C18（2） 250 mm×4.6 mm色谱柱；流动相：甲醇（A）-0.5%醋酸水（B）为流动相系统梯度洗脱（0～25 min，25%35%A；25～60 min，35%60%A）；检测波长：290 nm；流速：1.0 ml/min；柱温：30℃；进样体积：10 μl。 结果 紫丁香苷的线性范围为0.3051～6.102 μg（r=0.9992），平均回收率为99.67%。 结论 RP-HPLC检测效率高，专属性强，重复性好，可用于救必应药材中有效成分紫丁香苷的定量测定，可作为该药材的质量控制方法之一。

[关键词] 救必应；紫丁香苷；质量控制；反相高效液相色谱法

[中图分类号] R284 [文献标识码] A [文章编号] 1674-4721（2016）01（c）-0075-02

[Abstract] Objective To establish a method for RP-HPLC determination of syringin in Ilex rotunda Thunb.. Methods A Kromasil-C18 Column （250 mm×4.6 mm） was used with gradient elution using methanol-0.5% acetic acid as mobile phase.The detection wavelength was 290 nm and the column temperature was 30℃ with the flow rate of 1.0 ml/min，the samplem injection was 10 μl. Results Linear ranges of syringin was 0.3051-6.102 μg （r=0.9992），respectively.Its average recoveries was 99.67%. Conclusion The RP-HPLC method established in this experiment can be used to determine the contents of syringin in Ilex rotunda Thunb..The method can also be used as the standard for the quality control of Ilex rotunda Thunb. because of simplicity，reliability and accuracy.

[Key words] Ilex rotunda Thunb.；Syringin；Quality control；Reverse phase high performance liquid chromatography

救必应别名白木香、白沉香、山冬青等[1-2]，来源于冬青科植物冬青（Ilex rotunda Thunb.）的干燥树皮。夏、秋二季剥取，晒干，具有清热解毒，利湿止痛，用于暑湿发热，咽喉肿痛，湿热泻痢，脘腹胀痛，风湿痹痛，湿疹，疮疖，跌打损伤[3]。其主要含有三萜类、黄酮类、酚类、鞣质类化学成分[4-5]，紫丁香苷是救必应药材的主要有效成分之一[6]。HPLC法测定救必应药材中紫丁香苷含量[7-10]，此方法简便、准确、重复性好等特点，适用于救必应药材中紫丁香苷的含量测定。本研究采用反相高效液相色谱法（RP-HPLC）对其进行含量测定。

1 仪器与材料

1.1 仪器

Waters e2695高效液相色谱系统，Empower工作站，含四元梯度泵、自动进样器、紫外检测器（Waters公司；KQ-100B型超声波清洗器（昆山超声仪器有限公司）；T-214型电子分析天平（Denver公司）。

1.2 材料

紫丁香苷对照品（批号111574200603）购自中国药品生物制品检定所，供含量测定用；冰乙酸（天津市化学试剂研究所，色谱纯）；甲醇（Honeywell公司，色谱纯）；水为超纯水（实验室制备）。救必应药材12批，收集于各药材市场或产地采集，由湖南中医药大学龚力民讲师鉴定为冬青科植物冬青的干燥树皮。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱Aglient 5HC-C18（2）250 mm×4.6 mm，流速：1.0ml/min；柱温：30℃；检测波长：290 nm；进样体积：10 μl；流动相：甲醇（A）-0.5%醋酸（B）为流动相系统梯度洗脱（0～25 min，25%35%A；25～60 min，35%60%A）。按照上述色谱条件测定，待测成分紫丁香苷分离好，无干扰（图1）。

2.2 供试品溶液制备

取药材粉末（过60目筛）约1 g，精密称定，置100 ml具塞锥形瓶中，精密加入甲醇20 ml，密塞，称重，超声处理（功率160 W，频率59 kHz）30 min，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，0.22 μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得供试品溶液。

2.3 对照品溶液的制备

精密称取紫丁香苷对照品适量，加甲醇溶解定容至10 ml，得到浓度为1.2204 mg/ml的对照品溶液，再稀释约4倍，得到约0.3051 mg/ml的对照品溶液。

2.4 标准曲线的制备

分别精密吸取“2.3”项下的紫丁香苷对照品溶液1、3、5、8、10、15、20 μl进样分析，记录按上述色谱条件测定的峰面积。以峰面积为纵坐标（Y），进样体积（μl）为横坐标（X），得紫丁香苷的线性回归方程分别为：Y=182 081X-106 174，r=0.9992，结果说明紫丁香苷在0.3051～6.102 μg范围内与峰面积具有良好的线性关系。

2.5 精密度试验

取同一供试品溶液，按上述RP-HPLC分析条件。连续进样6次，计算紫丁香苷峰面积，峰面积RSD

2.6 重现性试验

取同一批号样品，平行制备6份供试品溶液，进行RP-HPLC分析，考察紫丁香苷峰面积，峰面积RSD

2.7 稳定性试验

取同一供试品溶液，分别在0、1、2、4、8、12、24、48 h进行1次，记录峰面积，峰面积RSD

2.8 回收率试验

精密称取已测紫丁香苷含量的同一批救必应药材粉末约0.5 g，分别精密加入紫丁香苷对照品适量，按照“2.2”项下制成供试品溶液，按上述色谱条件测定含量，计算回收率，平均回收率为99.67%，RSD

2.9 含量测定

按照上述色谱条件，将12批救必应药材供试品溶液进行分析，所得结果见表2。

3 讨论

3.1 供试品的制备

本实验根据救必应的有效成分紫丁香苷的性质选择甲醇作为提取溶剂，采用超声提取30 min，结果表明紫丁香苷溶解性好，提取完全。

3.2 色谱条件的优化

紫丁香苷对照品溶液在紫外光谱190～400 nm波长扫描测定中于290 nm处有最大吸收波长，因此选择290 nm为检测波长。在流动相系统选择中，分别以甲醇-水、甲醇-0.5%醋酸进行梯度洗脱，结果表明紫丁香苷峰型对称且分离度较好。最终确定流动相甲醇（A）-0.5%醋酸（B）为流动相系统梯度洗脱（0～25 min，25%35%A；25～60 min，35%60%A）。

3.3 含量的测定

由试验数据发现，不同产地的救必应药材紫丁香苷的含量差异较大，可能受生长环境、生长时间、采摘时间等因素的影响，其中以药植园的救必应药材含量相对偏高，是否人工培养的救必应药材中紫丁香苷的含量高于野生生长的救必应药材，有待进一步研究。

[参考文献]

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[7] 巫莹莹，黄少玲，彭洁明.高效液相色谱法测定复方救必应胶囊中丁香苷的含量[J].中药材，2003，26（10）：755.

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[9] 李惠琴.不同来源救必应紫丁香苷的含量测定[J].海峡药学，2014，26（10）：57-58.

[10] 毕福均，钟顺好，陈蔼，等.HPLC法同时测定救必应药材中紫丁香苷和长梗冬青苷[J].中草药，2010，41（8）：1386-1388.

（收稿日期：2015-09-22 本文编辑：卫 轲）