外源性IGF-I对大鼠运动骨骼肌mTOR及下游信号的影响

【前言】外源性IGF-I对大鼠运动骨骼肌mTOR及下游信号的影响由文秘帮小编整理而成，但愿对你的学习工作带来帮助。(1.Beijing Sport University，Beijing 100084，China; 2 . Physical Education Department，Tianshui Normal University，Tianshui 741001，G ansu China) Abstract: Objective: The purpose of this study was to examine the effect of mTOR and downs tream of mT...

摘 要： 目的：通过观察一周注射外源性igf-i和跑台运动对mTOR及其下游信号的影 响，以深入探讨IGF-I对运动骨骼肌蛋白合成信号的影响机理。方法：8周龄雄性SD鼠在适应 性训练后分为四组：安静组（S）、IGF-I组（SI）、运动组（E）、运动+IGF-I组（EI）， 每组6只。运动方式为跑台运动（坡度为10%，跑速20 m/min，60min），每天一次，共7 d。 外源性IGF-I为小腿后侧肌肉隆起处的皮下注射。用Western Blotting法检测腓肠肌MHC、mT OR（Ser2448）、p70S6K（Thr389）和4EBP1（Thr37/46）的磷酸化表达。结果：在一 周后，外源性IGF-I显著促进骨骼肌湿重和MHC的表达。外源性IGF-I和运动均显著促进骨骼 肌mTOR（Ser 2448）（P

关键词：IGF-I；mTOR通路；骨骼肌肥大；运动

中图分类号：G804.2文献标识码：A文章编 号：1007-3612(2011)04-0047-04

Effects of Exogenous IGFI and Exercise on mTOR and Downstreamsof mTOR of Skeletal Muscle in Rats

ZENG Fanxing1，ZHU Han1，ZHAO Hua2，OUYANG Qian1

(1.Beijing Sport University，Beijing 100084，China; 2 . Physical Education Department，Tianshui Normal University，Tianshui 741001，G ansu China)

Abstract: Objective: The purpose of this study was to examine the effect of mTOR and downs tream of mTOR on muscle protein synthesis in resistance treadmill exercise modelthrough injecting exogenous IGFI in vivo. Methods: Adult male SpragueDawle y rats (8 weeks old) were randomly divided into 4 groups after adaptive training : sedentary (S)，IGFI group (SI)，exercise group (E) and IGFI plus exercisegroup (EI). The following treadmill training was applied: 20m/min at 10% slope ，60 min; once per day，7 days. Rats were treated daily with IGFI (5.5 mg/kg ，diluted with saline) or saline local subcutaneously for 7 days. The MHC andphosphorylation of mammalian target of rapamycin (mTOR) (Ser2448)，70kDa ribos omal protein S6 kinase (p70S6K)(Thr389)，eIF4E binding protein 1(4EBP1)(Th r37/46) of gastrocnemius muscle were determined by western blotting. Results: A fter 1 week，wet weight and MHC of gastrocnemius muscle was promoted significant ly by exogenous IGFI(P

Key words: IGFI; mTOR pathway; muscle hypertrophy; exercise

运动在促进细胞内蛋白合成的过程中，涉及许多细胞内信号转导系统。在肌肉形态发生 变化之前，这些信号通路中各信号分子的表达就已经发生了改变。在这些调控肌肉蛋白合成 信号通路中起着核心作用的，就是mTOR通路［1-2］，对mTOR通路的抑制能阻断95%的 肌肉肥大 效应［2］。IGF-I具有极强的促肌肉蛋白合成效应。肌肉蛋白合成的主要信号通路为 PI3K/Ak t/mTOR通路，是IGF-I发挥效应的主要通路。p70S6K和4EBP1为mTOR的下游信号，是蛋 白质翻 译的起始与延长过程所必需。本研究从mTOR及其下游信号（p70S6K和4EBP1）为着眼 点，观 察该通路在注射一周IGF-I的耐力运动模型中的变化特征及与蛋白合成的关系，研究IGF-I对 运动骨骼肌蛋白合成的调控机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物与分组健康雄性、SPF级8周龄SD大鼠，体重(177.8±5.4)g，由北京维通利华 实验动物技术有限公司提供。国家标准啮齿类动物饲料，分笼饲养，4只/笼。 自由饮食，温度维持在22～24℃，相对湿度50%～65%。昼夜节律人工控制光照（光照时间为 8:00-20:00）。

在适应性训练后，动物经体重分层后随机分为四组：安静组（S）、IGF-I组（SI）、运 动组（E）、运动+IGF-I组（EI），每组6只。各组体重无显著差异。

1.2 动物运动方案 正式训练前，动物在跑台上进行4 d的适应 性训练，之后休息3 d。适应性训练方案见表1。

正式实验共7 d，安静组常规饲养，运动组进行7 d的运动，运动方案为上坡跑（坡度为10% ），速度20 m/min，每天训练60 min。（根据Bedford经验公式，相当于75%VO2max） ［3］。运动时间为每日上午8:00-9:00。

1.3 IGF-I注射方案 IGF-I为大鼠小腿后面肌腹隆起处的皮下注 射。每天运动后即刻，SI和EI组在大鼠小腿后肌腹隆起处的皮下注射IGF-I。其他组注射同 等剂量的生理盐水。具体剂量安排如表2。

1.4 测试样本采集与处理 取材前禁水禁食12 h，以0.3 m L/100 g为剂量，腹腔注射10%水合氯醛麻醉。麻醉后腹主动脉取血，然后速取后肢腓肠肌。 接着用生理盐水将其洗净，剔除肌腱及筋膜组织，用干净滤纸将其吸干，用锡纸将其包裹后 迅速投入液氮，而后置于-80℃冰箱保存待测。

1.5 指标测试方法

1.5.1 提取蛋白 匀浆缓冲液的配制：取RIPA裂解液100 mL， 分别加入蛋白酶抑制剂和蛋白磷酸酶抑制剂（Roche公司）各10片，最后取100 mM PMSF 1 0 00 加入。PMSF于临用前数分钟加入。于匀浆前新鲜配制。

用精密天平称取腓肠肌120 mg，用眼科剪迅速剪碎，按1:10比例向玻璃匀浆器中加入预冷的 裂解液，再在冰水浴中进行匀浆，直至没有肉眼可视的悬浮物。将组织匀浆液倒入1.5 mL EP管中，静置10 min。于4℃，12 000 g，10 min离心，取上清液，分装后保存于-80℃待测 。

1.5.2 蛋白浓度测试（Bradford法） 配制Bradford工作液： 按照《精编分子生物学实验指南》配制［4］。

标准曲线制备：用1 mg/mL BSA标准蛋白分配制0、10、20、40、60、80、100 梯度。 加入5 mL Bradford工作液，用旋涡混匀器混匀后静置5 min。测A595nm。制作标准曲线后， 再分批次测试样品浓度。

1.5.3 Western Blot测试Tris-甘氨酸电泳缓冲液、上样缓冲液、电转液、堆积胶和分离胶的配制均参照《Curre nt protocols in protein science》实验方法［5］，TBS、TBST、封闭液按照CellSignaling抗体说明书的要求配制。

取100 总蛋白配制成上样体系，置95℃沸水中 5 min，再于4℃中冷却，上样前以3 000rpm离心5 min。配制分离胶6%（MHC、mTOR）、8%（Actin、p70S6K）、10%（ -actin）或 16.5%（4EBP1），以及5%浓缩胶。浓缩胶用80V恒压，分离胶换120V恒压电泳。再用半干转 将蛋白转到NC膜上，以恒压20 V半干转。封闭90 min后用加入一抗，不同抗体稀释比例分别 为 -actin（购自Santa Cruz公司）为1:500，Fast Myosin Skeletal Heavy chain antibo dy ［MY-32］（Abcam公司）为1:2 000，Phospho- mTOR(Ser2448)（Cell Signaling公司） 为1:800，Phospho-p70S6K（Thr389）（Cell Signaling公司）为1:1 200，Phospho-4E-B P1（Thr37/46）（Cell Signaling公司）为1:800，然后4℃孵育过夜。次日晨在用TBST洗膜 后用不同浓度二抗室温孵育60 min。用ECL发光试剂与膜在暗室中反应、曝光。曝光底片用 凝胶成像 系统的透光进行拍照，用Quantity One图像分析系统分析。将每个条带与相应样品的 -act in条带光密度值进行比较，计算出目的条带的相对含量值。

1.6 数据处理

对实验检测结果的数据处理采用SPSS 13.0软件。组间比较采用双因素方差 分析（UNIANOVA）和单因素方差分析（One-Way ANOVA）。对观测点的组间多重比较（PostHoc）采用LSD或Tamhane’s T2方法分析。显著性检验水平以P

2 结 果

2.1 大鼠腓肠肌湿重值大鼠腓肠肌取材后立即在精密天平上进行称重，此时值为肌肉湿重绝对值（表3），再用其 与各自体重相比，得出相对值（表4）。SI组（P

2.2 外源性IGF-I和运动对大鼠骨骼肌MHC、mtor及下游信号的变化 在一周的实验后，分别测得各个实验动物组腓肠肌的MHC和mTOR及下游信号表达值 在一周后，IGF-I显著促进骨骼肌MHC表达（P0.05） 。外源性IGF-I显著促进骨骼肌mTOR（Ser 2448）（P

3 讨 论

3.1 IGF-I对MHC的影响

Lee等（2004）［6］用腺病毒介导的IGF-1基因注射到大鼠肌肉中成 功获得转基因大鼠，获得了长时间稳定的体内IGF-1过量表达的动物模型，发现动物肌肉重 量增加，肌原纤维中总蛋白含量增加。而同时许多研究也发现，肌肉肥大与循环血中的IGF- I并无太多联系，而是与组织局部IGF-I的关系更为密切。Matheny等（2009）［7］发 现大力量 训练后，小鼠肌肉的肥大效应明显增强，股四头肌、腓肠肌和跖肌的肌重均有相当的增加。 但循环血内的IGF-I的浓度却并没有表现出明显变化。Adams等发现（1998）［8］SD 鼠胫骨前 肌注射人类重组IGF-I（剂量为0.9 d，持续3周；或1.9 d，持续2周），胫骨前 肌 （TA肌）的重量均发生明显增加。为此，本研究采用局部注射IGF-I的方法来研究IGF-I促骨 骼肌蛋白合成的机制。

本研究取材肌肉为腓肠肌，为典型的以快肌纤维为主的肌肉，其MHC IIb型达到约90%，IId/ x型约10%［9］。本研究发现，腓肠肌湿重与其MHC的变化相似。局部外源性注射IGF- I（P 0. 05）。结果表明，一周的外源性IGF-I局部注射明显高于运动对骨骼肌肥大的促进效应。

3.2 IGF-I对运动骨骼肌mTOR及其下游信号的影响 mTOR的促合 成效应主要是通过对p70S6K和4EBP1的磷酸化来实现的。活化的mTOR一是通过激活下 游信号p70S6K使其磷酸化，从而促进5’TOP mRNA翻译，提高mRNA的翻译能力［1 0,11］；二是通过激活4EBP1磷酸化调节eIF4E的活性，来提高翻译的起始效率，从而促进 翻译的起始和延伸过程，增加蛋白合成［12］，最 终导致骨骼肌肥大。mTOR的这两种下游信号能被雷帕霉素所阻断，并能在离体情况下被重组 mTOR所激活［13，14］。Bodine（2001）［2］发现用雷帕霉素能阻断95%的肌 肉肥大。且在离体 情况下，Akt/mTOR通路及其下游信号――p70S6K和4E-BP1的激活能影响骨骼肌纤维的 形态与 功能，并能对抗废用性肌萎缩。这提示mTOR及其下游信号是肌肉肥大过程中的关键调节因子 。Fujita（2007）［15］发现促人体合成的营养素能敏感地被mTOR所感受到，引发一 个迅速地 和有效地通过加强翻译的起始和延伸过程（mTOR、p70S6K、4EBP1磷酸化均显著增 加），来 促进人骨骼肌蛋白的合成。在体情况下，由Akt/mTOR通路所激活的基因能充分的引起肌肉肥 大，阻止肌肉萎缩，而它们的阻断剂能阻断在体情况下的肌肉肥大。本研究发现，一周外源 性的IGF-I能够刺激mTOR（Ser2448）蛋白磷酸化水平显著性增加约6%。

p70S6K在真核细胞翻译和细胞进程中具有非常重要的作用，p70S6K参与mRNA转 录的起始过程，能在p70S6K激活后能促进5’TOP mRNA的翻译，提高mRNA的翻译效率 ，它被认为是这一过程所必需的。虽然这些转录仅为100到200个基因，但他们能编码细胞mR NA的20%。这些编码的产物有核糖体蛋白、延长因子等，这些都是蛋白质生物合成的基因，p 70S6K调控着翻译组件的生物合成［16］。它可以磷酸化调节mRNA翻译过程中 的至少3种蛋白，包括elF4B、核 糖体蛋白S6和真核翻译延伸因子eEF2。其Thr389位点的磷酸化是p70S6K被激活的标志 。本研究发现，一周注射外源性的IGF-I能够刺激p70S6K（Thr389）蛋白磷酸化水平 显著性增加约16%。

4E-BP1即eIF4E结合蛋白，又称PHAS1。真核细胞mRNA翻译的有效起始依赖于eIF-4F复合 体，后者由eIF-4E、eIF-4A、eIF-4G组成。eIF-4E和eIF-4G的活性被eIF-4E结合蛋白――4E -BP。哺乳动物细胞在通过G1期相当地受到eIF-4E面对其抑制蛋白4E-BP1时表现翻译率的影 响 。4E-BP1能抑制翻译起始所必需的帽子结构，进而控制翻译过程［17］。本研究发现 ，一周外源性的IGF-I能够刺激4E-BP1（Thr37/46）蛋白磷酸化水平显著性增加约30%。

本研究显示，mTOR及其两个重要下游信号p70S6K和4E-BP1的活性均表现出明显增强， 且变化趋势相似。在mTOR活性表达有一定增强后，位于其下游的p70S6K和4E-BP1的活 性均有更为显著的变化。这些结果提示IGF-I通过激活PI3K/Akt/mTOR等一系列信号 途径作用于p70S6K和4E-BP1，从而对蛋白质合成的关键环节――翻译过程发生作用。

3.3 IGF-I和运动对骨骼肌mTOR及其下游信号影响本研究结果表明，外源性IGF-I和运动均 促进骨骼肌蛋白合成过程。一周的实验后，IGF-I非常显著促进腓肠肌湿重与MHC的增长，运 动有促进它们的趋势。而且，IGF-I和运动这两个因素在各自发挥促进蛋白合成效应的同时 ，二者间存在协同促进效应。如SI组和EI组的MHC均显著高于S组和E组（分别为18%和15.7% 、23%和20.6%）。这两个因素对mTOR及下游通路影响有相似之处，表现为在mTOR活性表达 有一定增强后，位于其下游的p70S6K和4EBP1的活性均有更为显著的变化。而整个的 蛋白合成效果来说，一周注射外源性IGF-I的影响是大于一周的运动。而以往研究表明，运 动在促进肌肉蛋白合成过程中，很大程度是通过IGF-I因子为媒介，激活位于其下游的系列 信号通路 ，尤其是激活PI3K/Akt/mTOR通路来增强骨骼肌蛋白合成［18, 19］。但在观察到上 述IGF-I与 运动协同效应的同时，二者对腓肠肌肌肉蛋白合成与mTOR及其下游信号的影响表现有所差异 。一周外源性注射IGF-I对肌肉蛋白合成的效应大于运动，而且还发现显著促进mTOR及其下 游信号表达时，下游信号的变化更为明显。这显示越是下游的信号，对外界环境变化的反应 就更为敏锐，尤其是4EBP1活性的变化尤为明显。

4 结 论

1）一周外源性IGF-I注射明显促进骨骼肌蛋白合成，且明显强于运动的促合成效应。

2）一周外源性IGF-I注射与运动均能明显促进运动骨骼肌mTOR及其下游信号的活性。

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