外源性硫化氢对高糖诱导人腹膜间皮细胞氧化应激的影响

【摘 要】目的：外源性硫化氢（H2S）对高糖诱导人腹膜间皮细胞氧化应激的影响。方法：用4.25% D-葡萄糖（高糖）和外源性H2S供体硫化氢钠（NaHS）处理人腹膜间皮细胞株HMrSV5细胞24h，流式细胞术检测细胞内的内活性氧（ROS）水平，检测细胞内丙二醛（MDA）含量和超氧化物歧化酶（SOD）的活性。结果：与对照组比较，高糖组HMrSV5细胞内ROS水平显著增加，MDA含量显著增加而SOD的活性显著降低。与高糖组比较，10-3 mol/L的NaHS显著抑制了高糖诱导的细胞内ROS和MDA水平的增加以及SOD活性降低。结论：外源性H2S抑制了高糖诱导的人腹膜间皮细胞氧化应激。

【关键词】人腹膜间皮细胞；高糖；氧化应激

【中图分类号】R446 【文献标识码】A 【文章编号】1004-7484（2013）05-0158-02

硫化氢（hydrogen sulfide， H2S）被称为体内的第三种气体信号分子， 广泛分布于内脏、心血管和神经系统等组织，其生理作用非常广泛，也参与了多种疾病的发生发展[1]。研究表明H2S在许多器官和系统中发挥清除氧自由基、减少脂质过氧化物和抗氧化应激的作用[2-3]。因此本研究应用硫氢化钠（sodiumhydrosulfide，NaHS）作为H2S供体，旨在观察外源性H2S对高糖环境诱导的人腹膜间皮细胞氧化应激的影响。

1 材料和方法

1.1 材料

DMEM培养基（Invitrogen公司，美国），胎牛血清（杭州四季青公司，中国），胰蛋白酶、双氢-乙酰乙酸二氯荧光黄（ 2’-7’-dichlorofluorescin diacetate， DCFH-DA）、二甲基亚砜（dimethyl sulfoxide， DMSO） 、NaHS和D-葡萄糖（Sigma公司，美国）；丙二醛（malondialdehyde， MDA）和超氧化物歧化酶（superoxide dismutase， SOD）检测试剂盒（南京建成公司，中国）；流式细胞测定仪（Beckman公司，德国）、7l70型全自动生化分析仪（Hitach公司i，日本）。

1.2方法

1.2.1人腹膜间皮细胞（HMrSV5）的培养和分组

人腹膜间皮细胞株HMrSV5细胞购自中科院上海细胞库。细胞生长于含10% 小牛血清和2 mol/L的L-谷氨酰胺的DMEM培养基中，其中葡萄糖浓度5.5 mmol/L。实验分为以下组：对照组： 含1%小牛血清DMEM培养基培养HMrSV5细胞，培养基中含5.5 mmol/L 葡萄糖；高糖组：含4.25% D-葡萄糖培养基培养HMrSV5细胞24 h；甘露醇组：含4.25%甘露醇培养基培养HMrSV5细胞24 h；外源性H2S单独处理组：含10-3的外源性H2S供体NaHS的培养基培养HMrSV5细胞24 h；外源性H2S和D-葡萄糖共同处理组：细胞用含NaHS（10-3 mol/L）和4. 25%D-葡萄糖的培养基共同孵育HMrSV5细胞24 h。

1.2.2流式细胞仪检测细胞内活性氧（reactive oxygen species， ROS）水平

各组细胞处理时间结束后，以DCFH-DA 作为ROS 捕获剂，用10 μmol/L DCFH-DA 孵育各组细胞30 min，空白对照组不加DCFH-DA 处理。PBS漂洗后，0.25%胰蛋白酶消化后收集细胞，PBS漂洗1次后，在流式细胞仪上检测二氯荧光黄的平均荧光强度，激发光为氩离子激光488 nm谱线，每个样品测定10000个活细胞，以平均荧光强度代表细胞内ROS水平。

1.2.3细胞中MDA水平和SOD活性的测定

收集各组细胞，超声破碎细胞制备细胞匀浆，取细胞匀浆上清液100 μL，按试剂盒说明操作分别检测细胞匀浆上清液中MDA水平和SOD的活性。BCA法测定细胞匀浆上清液中蛋白浓度，MDA的水平以每克细胞蛋白所含MDA的μmol数（μmol/gpr）表示；SOD的活性以每100 mg细胞蛋白所含SOD活性的U数（U/100 mgpr）表示。

1.2.4统计学处理

数据均以 ±SD表示。组间差异的比较采用单因素方差分析；组间组间的两两比较采用LSD-t检验。采用SPSS 17.0统计分析软件对数据进行分析处理。P

2 结果

2.1高糖和外源性H2S对HMrSV5细胞内ROS水平的影响

以DCF平均荧光强度反映细胞内ROS水平，结果如图3所示：与对照组比较，高糖处理组HMrSV5细胞内ROS水平显著增加（t=4.28， P0.05）。10-3 mol/L外源性H2S供体NaHS与对照组比较没有显著影响细胞内ROS水平（t=1.34， P>0.05）。与高糖组比较，10-3 mol/L的NaHS显著抑制了高糖诱导的细胞内ROS水平的增加（t=3.12， P

图3高糖和外源性H2S对HMrSV5细胞内ROS水平的影响。*P

2.4高糖和外源性H2S对HMrSV5细胞内MDA水平和SOD活性的影响

结果如图4所示：与对照组比较，高糖处理组HMrSV5细胞内MDA水平显著增加（t=2.84， P0.05）与对照组比较差异没有显著性。10-3 mol/L外源性H2S供体NaHS与对照组比较没有显著影响细胞内MDA水平（t=1.12， P>0.05）和SOD活性（t=0.83， P>0.05）。与高糖组比较，10-3 mol/L的NaHS显著抑制了高糖诱导的细胞内MDA水平显著增加（t=2.59， P

图4高糖和外源性H2S对HMrSV5细胞内MDA含量和SOD活性的影响。*P

3 讨论

持续不卧床腹膜透析是终末期肾功能衰竭患者的主要治疗手段之一。但是长期腹膜透析可引起腹膜纤维化，导致腹膜超滤功能丧失，并最终退出腹膜透析，然而其发病机理还不完全清楚。由于葡萄糖价格较低，大部分腹膜透析液以葡萄糖作为渗透剂。研究认为腹膜透析液中高浓度的葡萄糖是引发腹膜纤维化的重要原因[4]。研究显示高浓度葡萄糖的腹膜透析液可引起腹膜间皮细胞损伤，使腹膜间皮细胞的形态、结构和功能都发生了变化，细胞外基质分泌增加，导致腹膜纤维化，最终导致腹膜超滤功能丧失[5]。因此保护腹膜间皮细胞是防止腹膜纤维化和腹膜超滤衰竭的主要途径。

腹膜透析患者体内都普遍存在氧化应激，而氧化应激是高糖损伤腹膜间皮细胞，引起腹膜纤维化的重要机制[6]。氧化应激是指机体在遭受有害刺激时，产生了大量的活性氧自由基，超出了机体对其清除能力，从而对细胞造成巨大的损伤。腹膜透析液中高浓度葡萄糖可通过二酰甘油-蛋白激酶C、PI3K-Akt和NADPH氧化酶等多种途径促进腹膜间皮细胞内活性氧的产生，导致氧化应激产生[7]。MDA是活性氧发生脂质过氧化的终产物，是衡量腹膜间皮细胞发生氧化应激的指标之一。SOD是清除体内活性氧自由基的主要自由基清除剂，通过催化超氧化物发生岐化反应而清除自由基。

研究表明H2S 同NO和CO一样，具备作为机体细胞内及细胞间传递信息的信使物质的基本条件，被称为第三种气体信号分子。在哺乳动物细胞内，H2S经胱硫醚1裂解酶、胱硫醚β合成酶和半胱氨酸转移酶等催化产生[8]。在体内H2S有NaHS和气体H2S 两种形式。NaHS在体内液体环境中离解为硫氢根离子和钠离子，而硫氢根离子与氢离子结合生成H2S，H2S 和NaHS之间保持动态平衡[9]。NaHS比H2S更能够保证溶液中H2S浓度的稳定性和精确度，因此NaHS 常作为外源性H2S的供体使用。H2S 的生理和病理生理作用十分广泛，目前还没有完全阐明清楚，它不仅参与了机体许多生理功能的调节，而且还参与许多疾病的发生发展[10]。我们的结果显示高糖导致细胞内氧化应激的产生，而外源性H2S显著抑制了高糖诱导的细胞内ROS水平的增加，细胞内MDA水平增加和SOD活性降低。这些结果表明H2S抑制腹膜间皮细胞中高糖诱导的氧化应激。

总之，我们的研究表明外源性H2S抑制了高糖诱导的人腹膜间皮细胞中氧化应激。

参考文献：

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