外阴恶性肿瘤中P21\ILK及HPV 6/11\HPV 16/18的检测及意义

[摘要] 目的:探讨P21、ILK及HPV 6/11、HPV 16/18与外阴恶性肿瘤的关系。方法:p21、ilk用免疫组化SP法检测,hpv 6/11、hpv 16/18用原位杂交法(ISH)检测。结果:外阴恶性肿瘤组、外阴上皮内瘤变(VIN)组、正常组中,P21、ILK的阳性表达率分别为40.00%(12/30)、52.38%(11/21)、0(0/10)和63.33%(19/30)、47.62%(10/21)、0(0/10);外阴病变各组P21、ILK的阳性表达率均显著高于正常组(P

[关键词] 外阴恶性肿瘤;人瘤病毒;P21;ILK

[中图分类号] R737.35[文献标识码]A [文章编号]1673-7210(2010)02(a)-013-03

Detection and significance of P21, ILK and HPV 6/11, HPV 16/18 in vulvar m alignant tumor

LI Shengshui1, GE Fengqin2, LIU Chunzai3, XU Hua1, LI Shuangbiao1, ZHANG Fengmei1, LIU Yan1

(1.Department of Pathology, Cangzhou Hospital for Integrated Chinese and Western Medicine, Hebei Province, Cangzhou 061001, China; 2.Cangzhou Infectious Disease Hospital, Hebei Province, Cangzhou 061001, China; 3.Nandagang Hospital, Hebei Province, Cangzhou 061103, China)

[Abstract] Objective: To investigate the relationships between P21, ILK and HPV 6/11, HPV 16/18 and vulvar m alignant tumor. Methods: P21 and ILK were stained immunohistochemically, and HPV 6/11 as well as HPV 16/18 were detected by using in site hybridization method. Results: The expression rates of P21 and ILK in vulvar m alignant tumor group, VIN group and normal group were 40.00% (12/30), 52.38% (11/21), 0(0/10) and 63.33% (19/30), 47.62% (10/21), 0 (0/10) respectively, with significant difference among the vulvar lesions and normal skin epithelium (P

[Key words] Vulvar m alignant tumor; Human papilloma virus; P21; ILK

研究表明,外阴多种病变与人瘤病毒(HPV)感染有关,高危HPV感染则是引起外阴恶性肿瘤的重要原因之一[1]。在外阴恶性肿瘤的发生及发展过程中,HPV感染与P21、ILK蛋白过度表达是否存在一定的联系,目前国内文献报道较少。本研究通过免疫组化SP法及原位杂交法(ISH)检测P21、ILK及HPV 6/11、HPV 16/18在外阴恶性肿瘤、外阴上皮内瘤变(VIN)组织中的表达情况,进而综合分析在不同HPV感染的状态下,P21和ILK的表达与外阴恶性肿瘤发生、发展及预后的关系,有助于全面理解外阴恶性肿瘤的生物学特征,为临床诊断、治疗及判断预后提供有价值的生物学指标。

1 资料与方法

1.1 一般资料

标本取自1992～2009年沧州中西医结合医院因外阴病变而行手术切除的患者,入院后均行外阴广泛切除术加腹股沟盆腔淋巴结清扫术。外阴恶性肿瘤30例,其中,腺癌2例,基底细胞癌2例,外阴鳞癌26例(角化鳞癌21例,疣状鳞癌5例);癌组织高分化11例,中分化12例,低分化7例;病理分级G1 19例,G2 6例,G3 5例;肿瘤直径≤2 cm者8例,>2 cm者22例。全部病例术前均无放疗、化疗史;病程1～5年;年龄30～83岁,平均56.5岁。外阴上皮内瘤变(VIN)21例,其中,VINⅠ 6例,VINⅡ 8例,VINⅢ 7例;年龄30～71岁,平均55.5岁。10例正常皮肤组织为对照组,其中,5例为外阴手术阴性切缘,5例正常外阴组织;年龄35～87岁,平均61.0岁。所有标本均经10%中性甲醛溶液固定,石蜡包埋,4 μm连续切片。

1.2主要试剂

一抗分别为鼠抗人P21单克隆抗体,鼠抗人ILK单克隆抗体,HPV 6/11、HPV 16/18原位杂交检测试剂盒(含生物素标记的HPV 6/11、HPV 16/18探针)和SP试剂盒。以上试剂均购自福州迈新公司。

1.3 实验方法

P21及ILK检测采用免疫组化SP法;HPV 6/11及HPV 16/18检测采用原位杂交法。实验步骤严格按说明书进行。

1.4 结果判定

P21及HPV 6/11、HPV 16/18均显示细胞核着色,光学显微镜下见到细胞核内出现棕黄色颗粒为阳性染色;ILK在细胞内的阳性表达主要位于肿瘤细胞的胞质内,出现浅或棕黄(褐)色颗粒。评分方法:参照Fomwitz综合计分法并略加修改,行半定量分析:随机抽样在高倍镜下计数肿瘤细胞总数和阳性细胞个数,然后得出阳性细胞百分率,着色强度按多数阳性细胞呈现的染色程度分为4级:阴性(-),即阳性细胞数

1.5 统计学处理

数据经SPSS 10.0软件分析,用行×列联表χ2检验,各指标的相关关系用Spearman等级相关分析,P

2 结果

2.1 P21及ILK在各组中的表达情况

P21在外阴恶性肿瘤组、VIN组中的阳性表达率显著高于正常组(P

表1 P21和ILK在各组中的表达(例)

2.2 HPV 6/11、HPV 16/18在各组中的感染情况

外阴恶性肿瘤组和VIN组中HPV 6/11阳性表达率均显著高于正常组(P

表2 HPV 6/11、HPV 16/18在各组中的感染情况

2.3 HPV 6/11、HPV 16/18与P21、ILK的关系

HPV 6/11、HPV 16/18感染组中P21、ILK的阳性表达与无感染组比较,无显著性差异(P>0.05)。见表3。

表3 HPV 6/11、HPV 16/18感染与无感染者P21、ILK的检测(例)

2.4 P21与ILK、HPV 6/11、HPV 16/18的检测与外阴恶性肿瘤的临床病理特征及其相互关系

P21、ILK和HPV 6/11、HPV 16/18的阳性表达率与肿瘤大小、组织类型、鳞癌的病理分级、临床分期及淋巴结是否转移无关(rs=-0.022,P>0.05)。HPV 6/11、HPV 16/18与ILK和P21的表达无相关性(rs=-0.020,P>0.05),ILK与P21的表达也无相关性(rs=-0.015,P>0.05)。

3 讨论

p21基因是CIP家族中的一员,它是位于p53基因下游的细胞周期素依赖性激酶抑制因子。p21可以和p53共同构成细胞周期G1检查站,因DNA损伤后不经过修复则无法通过,减少了受损DNA的复制和积累,从而发挥抑癌作用[2-3]。p21可以通过细胞周期调控作用间接参与细胞凋亡(依赖p53途径)和直接导致细胞异化恶变(非依赖p53途径),可以正性调节细胞依赖性激酶功能,抑制PCNA与多聚酶γ结合,影响DNA复制和抑制应激蛋白激酶活性,可作为肿瘤分化程度及临床分期的参考指标之一[4]。

ILK是新近发现的一个具有3个结构单位的Ser/Thr蛋白激酶,作为整合素和生长因子受体信号传导途径中的一个重要效应物,ILK调节着细胞的黏着、生存、分化和凋亡[5]。其相关蛋白PKB、GSK3等是细胞程序性死亡和细胞周期循环的重要调节蛋白[6-7]。这些原因使得ILK与肿瘤的形成、浸润、转移和临床预后等密切相关。目前,ILK的功能紊乱在肿瘤发生中的作用仍有大量的理论问题有待解决[8-12]。

本研究结果表明,在各级VIN中均有P21及ILK表达,且阳性产物定位于非典型区,推测在异常细胞增殖的转化过程中,已有ILK及p21基因的扩增,并可通过蛋白水平检测出来。ILK在外阴恶性肿瘤中的阳性表达率明显高于VIN组,表明从外阴恶性肿瘤癌前病变到浸润癌的发展过程中ILK起重要的作用;而P21在外阴恶性肿瘤组与VIN组中的阳性表达率相似,推测在外阴恶性肿瘤的发展过程中P21的检出可能是一个早期事件。

本研究结果显示,P21及ILK阳性表达与外阴恶性肿瘤的临床分期、组织学分级、肿瘤的大小及淋巴结是否转移均无关,提示在外阴恶性肿瘤中,P21和ILK的过度表达可能只对细胞转化及恶性表型的维持有重要作用,而与外阴恶性肿瘤的预后无关。P21与ILK表达无相关性,推测在外阴恶性肿瘤中ILK的表达可能还受其他因素的影响。约1/3的外阴恶性肿瘤与HPV感染有关,在小于35岁的妇女中HPV感染率高达85%。本研究结果表明,在外阴恶性肿瘤及VIN组织中存在一定比例的HPV 6/11及HPV 16/18感染,推测HPV感染在外阴恶性肿瘤的发生及发展中起一定作用。同时,本研究结果显示,HPV 6/11、HPV 16/18感染与P21、ILK的表达无关。

总之,外阴组织的癌变是受多种因素作用的,笔者认为通过降低HPV感染率,对P21、ILK蛋白表达阳性的癌前病变积极干预,可以遏制细胞的持续转化,从而在一定程度上阻止外阴恶性肿瘤的发生及发展。

[参考文献]

[1]Garland SM, Insinga RP, Sings HL, et al. Human papillomavirus infections and vulvar disease development [J]. Cancer Epidemiol Biomarkers Prev,2009,18(6):1777-1784.

[2]Chang YW, Bean RR, Jakobi R. Targeting RhoA/Rho kinase and p21-activated kinase signaling to prevent cancer development and progression [J]. Recent Pat Anticancer Drug Discov,2009,4(2):110-124.

[3]Tian Q, Lu W, Chen H, et al. The nonsynonymous single-nucleotide polymorphisms in codon 31 of p21 gene and the susceptibility to cervical cancer in Chinese women [J]. Int J Gynecol Cancer,2009,19(6):1011-1014.

[4]Xu G, Wang H, He G. Expressions of p53 and p21 in nasal NK/T-cell lymphoma and their relationship with the proliferation and apoptosis of cells [J]. Lin Chuang Er Bi Yan Hou Tou Jing Wai Ke Za Zhi,2009,23(2):73-76.

[5]Abboud ER, Coffelt SB, Figueroa YG, et al. Integrin-linked kinase: a hypoxia-induced anti-apoptotic factor exploited by cancer cells [J]. Int J Oncol,2007,30(1):113-122.

[6]Honda S, Shirotani-Ikejima H. Integrin-linked kinase associated with integrin activation [J]. Blood,2009,113(21):5304-5313.

[7]Eke I, Hehlgans S, Cordes N. There's something about ILK [J]. Int J Radiat Biol,2009,85(11):929-936.

[8]McDonald PC, Dedhar S, Keller C. Integrin-linked kinase: both Jekyll and Hyde in rhabdomyosarcoma [J]. J Clin Invest,2009,119(6):1452-1455.

[9]L■ssner D, Abou-Ajram C, Benge A, et al. Integrin alphavbeta 3 upregulates integrin-linked kinase expression in human ovarian cancer cells via enhancement of ILK gene transcription [J]. J Cell Physiol,2009,220(2):367-375.

[10]Goulioumis AK, Bravou V, Varakis J, et al. Integrin-linked kinase cytoplasmic and nuclear expression in laryngeal carcinomas [J]. Virchows Arch,2008,453(5):511-519.

[11]Wang S, Basson MD. Integrin-linked kinase: a multi-functional regulator modulating extracellular pressure-stimulated cancer cell adehesion through focal adhesion kinase and AKT [J]. Cell Oncol,2009,31(4):273-289.

[12]B■ttcher RT, Lange A, F■ssler R. How ILK and dindlins cooprerate to orchestrate integrin signaling [J]. Curr Opin Cell Biol,2009,21(5):670-675.

(收稿日期:2009-11-13)