一种简便快速提取细菌质粒的方法改进

【关键词】 质粒；提取；细菌

［摘要］ 介绍一种简便快速提取细菌质粒的改进方法，不需要按常规对细菌培养物离心和用溶液Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ处理，而是直接用酚-氯仿(1∶1)处理，离心分层取上清，异丙醇沉淀，所得质粒产量高，纯度足以用于酶切。

［关键词］ 质粒；提取；细菌

A Simple and Rapid Method to Isolate Plasmid

Abstract: A simple and rapid method to isolate plasmid from bacteria is introduced．Bacteria culture was treated by Phenol-CHCl3(1∶1)，upper aqueous phase was withdrawnand plasmid DNA was precipitated by isopropanol．The routine steps such as collectingbacteria by centrifugation and treating with Solution Ⅰ，Ⅱand Ⅲ were thus avoided．The plasmid obtained was pure enough for enzyme digestion．

Key words： Plasmid；Isolation；Bacilus

提取质粒可以说是分子生物学和基因工程研究中最基本常用的方法，在实践中大多采用碱变性法来提取质粒，该方法需要先离心收集细菌，而后用溶液Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ依次处理［1］。在筛选阳性重组克隆时往往需要对大量菌落进行培养后提取质粒进行酶切鉴定，用该方法还是比较费时费力的。目前已经有不少进口及国产的质粒快速提取试剂盒问世，但是它们的基本原理还是碱变性［2］，仍然需要对细菌离心，而后用变性液、中和液处理等。为此，我们经过探索，找到一种提取质粒的改进方法，即简便快速，而且所得质粒产量纯度都很好。原理很简单：酚-氯仿是变性剂，可以破坏细菌的细胞壁，质粒DNA就释放出来，而染色体DNA较大，与菌体一起分到下层，取出上层水相(质粒DNA在其中)，用异丙醇沉淀，离心使质粒DNA沉降下来，再用TE或H2O溶解质粒DNA沉淀，质粒即可用于酶切等分子生物学实验。现报道如下。

1　材料与方法

1．1　试剂　质粒载体PHB3，带有人带3蛋白cDNA，氨苄青霉素抗性，6．5 Kb，酶切片段396 bp，由复旦大学生命科学院院长张志鸿教授提供；菌株DH5a由本室冻存；1 Kb和10 Kb Marker，BamHI,EcoRI和RNase A购自Promega公司；质粒小量抽提试剂盒(上海博光生物科技有限公司)；蛋白胨和酵母提取物(Oxoid公司)；琼脂糖购自Sigma公司。

1．2　常规方法　试剂的配制和使用参照文献［3］；细胞培养参照文献［4］，常规37 ℃，饱和湿度和5％CO2。所有培养用器具和细菌培养基均经121 ℃，15磅高压湿性灭菌20 min。质粒转化采用TSS法制备和转化感受态细菌［5］。

1．3　质粒提取　分别接种含质粒PHB3的DH5a的细菌于2 ml LB培养基中，37 ℃振荡过夜。取出700 μl细菌培养到一个1．5 ml Ep管中，再加入700 μl Tris饱和酚-氯仿(体积比1∶1)，混均后12 000 r离心3 min，小心取出上层液相(约600 μl )到一新Ep管中，加入等体积异丙醇，混均后12　000 r离心5 min，去上清，用1 ml 70%乙醇洗涤沉淀，真空或自然干燥后溶于50 μl 含RNase A(20 μl ／ml)的TE中。分光光度计测定质粒DNA的浓度和纯度。

1．4　酶切鉴定　用20 μl反应体系，分别取5 μl如上所提取的质粒PHB3，BamHI和EcoRI各1．0 U及2 μl相应10×buffer，剩余体积用ddH2O补齐，37 ℃水浴1．5 h后行1％琼脂糖凝胶电泳。

2　结果和讨论

采用以上方法从0．7 ml细菌培养物得到4．5 μg的PHB3，OD260：OD280为1．8，说明所提取的质粒浓度和纯度都较好。图1为质粒抽提电泳，在6 kp处条带清晰可见；图2为质粒PHB3酶切产物电泳，在400 bp处条带清晰可见。

图1　质粒PHB3质粒抽体电泳（略）

图2　质粒PHB3酶切产物电泳（略）

我们建立的这种简便快速提取细菌质粒的改进方法给分子生物学研究提供很好的技术手段，比如我们要克隆一个基因到一个质粒载体上，可以用此方法提取载体，酶切后电泳回收纯化，与目的基因连接，转化，再用此方法提取重组质粒进行酶切鉴定，筛选出阳性克隆。与常规的碱变性法比较，本方法更快，15 min～20 min就可完成，全过程室温操作即可，不需冰浴，而且省去配制溶液Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ等步骤，实际操作简便易行。

参考文献：

［1］　谈代明．现代医学分子生物学［M］．北京：人民军医出版社，2000：391394．

［2］　Sambrok J，Fritsch E F，Maniatis T．Molcular Cloning［M］．2nd ed．New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press．1989：125128．

［3］　萨姆布鲁克，EF弗里奇，T曼尼阿蒂斯，等．金冬雁，黎孟枫等译．分子克隆实验指南［M］.北京：科学出版社，1992：910913．

［4］　司徒镇强，吴军正．细胞培养［M］．西安：世界图书出版社，1996：7083．

［5］　李永明，赵玉琪．实用分子生物学方法手册［M］．北京：科学出版社，1998：7477．