芍药甙对大鼠海马神经元的保护作用

【关键词】 芍药甙；缺氧；海马神经元；抗氧化剂

Neuroprotective effect of paeoniflorin on anoxically cultured rat hippocampal neurons

【Abstract】 AIM: To investigate whether paeoniflorin has the neuroprotective effect on anoxically cultured rat hippocampal neurons. METHODS: Hippocampal neurons were taken and grown for 1014 d, then divided randomly into 4 groups according to different culture mediums added with 5 μmol/L nimodipine, 40 or 80 μmol/L paeoniflorin, or no any medicine (as control group). Acute anoxia model was induced with 950 mL/L NO2+50 mL/L CO2 mixture gases.The viable cells were counted by trypan blue method. The apoptosis rate and death rate of hippocampal neurons was tested by flow cytometry (FCM). The contents of MDA and NO and the activities of SOD in the supernatants of cell culture were determined by biochemical methods. RESULTS: In comparison with the control group, paeoniflorin significantly increased the activities of SOD and decreased the contents of MDA and NO in the culture supernatants (P<0.01) and decreased the apoptosis rate of hippocampal neurons, which showed a doseeffect relationship. CONCLUSION: The paeoniflorin has the neuroprotective effect on hippocampal neurons against anoxic injury. The mechanism underlying this effect of paeoniflorin may be mediated by eliminating the free radicals, by increasing the activities of antioxidative enzymes to inhibit the oxidative damages caused by anoxia.

【Keywords】 paeoniflorin; anoxia; hippocampal neurons; antioxidants

【摘要】 目的： 观察缺氧对大鼠海马神经元的影响及芍药甙的保护作用. 方法： 采用细胞培养方法获取10~14 d的海马神经元,将药物加入到培养液中，4 h后建立950 mL/L NO2+50 mL/L CO2混合气体急性缺氧模型,台盼蓝染色细胞计数并做流式细胞仪检测,以及酶法测定抗氧化酶（超氧化物岐化酶SOD）的抗氧化能力及丙二醛（MDA），NO的含量. 结果： 离体条件下芍药甙组较对照组SOD活性升高,MDA及NO含量降低（P<0.01），且成量效比例关系,同时细胞凋亡率显著降低. 结论： 芍药甙在体外有抗缺氧损伤的作用,其作用机制可能是通过抑制细胞凋亡,提高抗氧化酶的活力,清除自由基而发挥作用.

【关键词】 芍药甙；缺氧；海马神经元；抗氧化剂

0引言

脑缺血时机体产生大量的氧自由基,且NO在体内局部浓度升高,与周围的氧自由基等反应而生成活性氮氧化合物,是一种强氧化剂,也可启动脂质过氧化. 自由基医学的研究表明,神经元的损伤、凋亡、坏死等与脂质过氧化密切相关,而抗氧化剂可通过清除自由基,提高抗氧化酶等途径有效地阻断或防止这一过程［1］. 芍药甙是芍药的主要成分之一,能够抑制花生四烯酸的代谢,具有抗血栓的作用,以及抗氧化和抗惊厥作用［2］. 但对其在神经细胞中的作用及机制研究甚少. 本试验通过体外培养海马神经元,建立急性气体缺氧模型,用台盼蓝染色细胞计数,流式细胞仪检测以及酶法测定抗氧化酶（超氧化物岐化酶）的抗氧化能力及丙二醛(MAD),一氧化氮(NO)的含量,探讨芍药甙是否有抗缺氧损伤的作用,以寻求预防和治疗脑缺血的药物.

1材料和方法

1.1材料新生1~3 d Wister大鼠,雄性,32只,第四军医大学实验动物中心提供. 芍药甙 (中国医学科学院药物所);尼莫地平(德国拜耳公司);DMEM,马血清(Gibco公司);胎牛血清(杭州四季青生物材料工程公司);超氧化物歧化酶(SOD),MAD,NO(南京建成生物工程研究所);多聚赖氨酸(Sigma公司). CO2细胞培养箱(上海福玛实验设备有限公司),垂直单向流型YJ超净工作台（苏州市洁净技术研究所）.

1.2方法

1.2.1海马神经元的培养和分组按已有的细胞培养方法［3］,取大鼠消毒,断头,分离出双侧海马,剪碎成1 cm3的组织块,加入1.25 g/L胰酶消化30 min,用含有100 mL/L胎牛血清及100 mL/L马血清的种植培养液终止胰酶的作用. 制成细胞悬液（1×109/L）接种到6孔板中(2 mL/孔),置于37℃ 50 mL/L CO2培养箱中培养24 h,更换维持培养液（50 mL/L胎牛血清,100 mL/L马血清）,以后每3 d半量换液1次,第4~5日加入阿糖胞苷,终浓度为5 mg/L(25 μL/皿). 接种10~14 d的海马神经元随机分为4组,即对照组,尼莫地平5 μmoL/L组,芍药甙40 μmoL/L组,芍药甙80 μmoL/L组. 每组4个6孔板： 将所用药物加入到细胞培养液中进行孵育.

1.2.2尼氏染色鉴定神经元将培养的海马神经元经0.02 mol/L PBS(pH 7.4)漂洗1~2次,40 g/L多聚甲醛溶液固定1 h, PBS漂洗后,10 g/L甲苯胺蓝染液染色20 min, 950 mL/L乙醇分色,37℃干燥,二甲苯透明,中性树脂封片.

1.2.3缺氧模型的制备［4］4 h后将已分组给药的培养板移入37℃恒温密闭容器中,连续充以950 mL/L NO2+50 mL/L CO2混合气体,流速为20 mL/min,持续1 h.

1.2.4海马神经元细胞凋亡率的检测将上述处理过的细胞制成单细胞悬液,1000 r/min离心10 min,去上清,PBS冲洗,700 mL/L乙醇固定,400目的筛网过滤,加PI染液,上流式细胞仪检测.

1.2.5海马神经元上清液中SOD,MDA和NO的测定按试剂盒说明书的要求先求出样本的最佳加样量,海马神经元经上述同样处理后,取细胞上清液,按试剂盒说明书的要求操作,测定各样本的吸光度,并依下列公式计算出SOD,MDA和NO的含量.

SOD活力(U/mL)=(对照管吸光度-测定管吸光度)/对照管吸光度/50%×反映体系的稀释倍数×样本测试前的稀释倍数

MDA含量(μmol/L)=(测定管吸光度-测定空白管吸光度)/(标准管吸光度-标准空白管吸光度)×标准品浓度(10 μmol/L)×样本测试前稀释倍数

NO含量(μmol/L)=(测定管吸光度-空白管吸光度)/(标准管吸光度-空白管吸光度)×标准品浓度(100 μmol/L)×样品测试前稀释倍数

统计学处理： 实验数据用x±s表示,用简明统计(cs2000)软件对实验结果先进行正态分布,方差齐性检验,若方差不齐,则进行F检验;若方差齐,则进行F检验.

2结果

2.1海马神经元的存活率分离出的海马细胞在接种之前,制备1×109/L细胞悬液,用2 mL/L的台盼蓝染色,计数着色细胞和未着色细胞数,活细胞数为97%. 光学显微镜下可见海马神经元胞质淡蓝色,尼氏体及核仁明显呈深蓝色.

2.2海马神经元SOD活性及MDA,NO的含量对照组SOD含量最低(P<0.01),MDA及NO含量则明显最高(P<0.01);尼莫地平及芍药甙低、高剂量组SOD活性依次升高,MDA及NO的含量则依次降低(表1).

表1各组海马细胞抗氧化酶活性及MDA,NO的含量(略)

aP<0.05 vs对照, bP<0.01 vs尼莫地平. MDA: 丙二醛.

2.3海马神经元凋亡率流式细胞仪测定PI荧光强度,分析各组细胞的凋亡率,对照组细胞凋亡率明显高于其他各组. 对照组海马细胞凋亡率为3.07%,尼莫地平组为0.49%, 40 μmol/L和80 μmol/L芍药甙组分别为0.44%, 0.28%.

3讨论

脑缺血或脑缺氧的研究中,人们发现海马是脑内对缺血、缺氧最为敏感的部位之一. 我们采用新生大鼠海马神经细胞培养模型,该模型可直接研究药物对神经细胞缺氧损伤的机制. 通过加入阿糖胞苷,可有效地抑制胶质细胞的生长,保证神经元的纯度［5］. 本试验分离的细胞经台盼蓝染色检查,成活率达95%以上.

尼氏体(Nissl bodies)常被称为嗜色小体或虎斑,主要成分由RNA和蛋白质组成. 由于含有RNA,易被某些碱性苯胺染料所染色,如甲苯胺蓝. 由此用来证明所培养的细胞中神经元占90%以上,可以认为是相对纯的神经细胞培养［6］. 脑缺血是临床上常见的一种疾病,细胞凋亡无论是在短暂性脑缺血,还是在永久性脑缺血中均是神经细胞死亡的主要形式［7-8］. 本实验采用PI单染法,通过流式细胞仪检测发现,对照组细胞凋亡率较其余3组升高. 说明缺氧能够引起细胞凋亡,而芍药甙能够抑制这种缺氧所引起的凋亡.

正常情况下体内产生少量自由基属生理范围,可被抗氧化防御系统清除,使自由基的产生及清除处于动态平衡状态. 当急性缺氧时,此平衡状态被打破,自由基积蓄从而造成脑损伤. 其中MDA含量的高低就可以反映机体内脂质过氧化的程度和细胞损伤的程度. 试验中,对照组的含量最高,给药组则依次降低（P<0.01）,说明缺氧损伤了细胞,这与文献［9］报道一致,而芍药甙有抗缺氧损伤的作用. 机体的防御系统中主要有SOD,其活力高低间接反映了机体清除氧自由基的能力,常与MDA相配对作为检测机体氧化程度的指标. 试验中,对照组中SOD明显降低,其余3组则依次升高（P<0.01）,说明缺氧抑制了SOD的活性. 这与MDA的结果相一致,说明芍药甙可通过抑制脂质过氧化发挥抗缺氧损伤的作用.

NO在脑缺血损害中所起的作用,一直是研究的重点. 近来研究发现,在脑缺血损伤过程中神经细胞中的NO合酶（NOS）过度表达,可催化产生NO,有超氧阴离子自由基(O2-)存在时,迅速与其反应生成氧化毒性更强的过氧亚硝基(ONOO2-)引起脂质过氧化反应,在损伤早期起关键作用［10］. 本实验表明,芍药甙组的NO含量明显低于其他各组（P<0.01）,这说明缺氧损伤细胞造成NO升高,而芍药甙可明显抑制其含量从而来保护细胞免受缺氧损伤.

【参考文献】

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［5］ 申军现，金卫林，鞠躬. 低密度体外培养大鼠海马神经元的形态学观察［J］. 第四军医大学学报,2003,24(6):489-491.

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［9］ 王晓英,罗嘉,邢虹,等. 神经元缺氧复氧损伤时氧自由基的毒性作用及其机制［J］. 生物物理学报,1999,15(2):375-380.

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