黄芪甲苷抑制高糖诱导的足细胞凋亡作用及机制

(1.浙江医院肾内科, 浙江 杭州 310013; 2.复旦大学附属华山医院中西医结合研究所, 上海 200040)

摘 要:目的:探讨黄芪甲苷(AS-IV)对高糖诱导的足细胞凋亡的作用及其机制。方法:条件性永生的小鼠足细胞分为正常糖组(NG)、高糖组(HG)、甘露醇高渗对照组(MA)及HG+不同剂量(10、50、100 μg/mL)黄芪甲苷干预组(AS-IV)。流式细胞仪及Hoechst染色检测细胞凋亡;荧光探针CM-H2-DCF-DA标记细胞检测活性氧(ROS)水平;Western印迹检测足细胞p38-MAPK活性。结果:高糖促进足细胞ROS的产生并引起足细胞凋亡,AS-IV明显抑制高糖诱导的ROS的产生及足细胞凋亡,且呈剂量依赖关系。此外,高糖激活p38-MAPK信号通路,AS-IV呈剂量依赖性抑制p38-MAPK活性。结论: AS-IV能减少高糖所致的足细胞凋亡,其机制可能与AS-IV抗氧化及抑制p38-MAPK活化密切相关。

关键词:黄芪甲苷;高糖;足细胞;凋亡;活性氧;p38-MAPK

中图分类号:R285.5 文献标识码:A 文章编号:1673-7717(2010)04-0822-03

Astragaloside IV Inhibited High Glucose-Induced Podocyte Apoptosis and Its Mechanism

GUI Dingkun1,CHEN Jianguo1,CHEN Yifang1,HUANG Jianhua2

(1.Department of Nephrology, Zhejiang Hospital, Hangzhou 310013,Zhejiang,China;

2.Institute of Integrated Chinese and Western Medicine, Huashan Hospital, Fudan University, Shanghai 200040, China)

Abstract:Objective: To study the effects of Astragaloside IV(AS-IV) on glucose-induced apoptosis of podocytes and explore its possible mechanism. Methods: Conditionally immortalized mouse podocytes were divided into nomal glucose group (NG) , high glucose group (HG), mannitol group (MA) and HG with 10, 50 and 100 μg/mL of AS-IV for 24h.Flow cytometry and Hoechst staning were used for the quantification of apoptotic podocytes. Reactive oxygen species (ROS) generation was measured with the fluoroprobe carboxymethyl-H2-dichlorofluorescein diacetate. The activation of p38-MAPK was determined by Western blot. Results: HG induced ROS generation and apoptosis of podocytes. AS-IV inhibited HG-induced ROS generation and apoptosis of podocytes in a dose-dependent manner. Moreover, HG caused p38-MAPK activation in podocytes, while AS-IV dose-dependently inhibited p38-MAPK activation.Conclusion: Astragaloside prevented high glucose-induced podocyte apoptosis and this effect may be involved in inhibition of ROS and p38-MAPK.

Key words:Astragaloside IV; high glucose; podocyte; apoptosis; ROS;p38-MAPK

收稿日期:2009-11-11

基金项目:浙江省老年医学重点学科群计划项目(2008ZJ006)

作者简介:桂定坤(1978-),男,湖北孝感人,主治医师,博士,从事肾脏病基础与临床研究。

糖尿病肾病(Diabetic nephropathy, DN)是糖尿病最常见且最严重的并发症之一,若能早期干预治疗DN,仍有希望阻止或延缓病情进展,然而,迄今尚无满意的防治早期DN的方法。近年来研究证实肾小球足细胞凋亡是早期DN进展的关键[1],因此,抑制足细胞凋亡将为防治早期DN带来新的曙光。DN属祖国医学“消渴”、“水肿”、“虚劳”等证范畴,关键病机为气阴两虚。黄芪益气健脾、利水消肿,是临床治疗DN的常用中药,黄芪甲苷(Astragaloside IV,AS-IV)是黄芪的主要活性成分之一,笔者前期研究发现AS-IV能改善高糖刺激下的足细胞黏附,从而保护足细胞[2],本研究进一步探讨AS-IV对高糖诱导的足细胞凋亡的作用及其机制。

1材料与方法

1.1主要试剂与仪器黄芪甲苷(成都思科华生物技术有限公司),RPMI1640培养液、胎牛血清(美国Gibco公司),Hoechst-33342、小鼠γ-干扰素(美国Sigma), Trizol试剂、荧光探针CM-H2-DCF-DA(美国Invitrogen),p38、磷酸化p38抗体(美国Santa Cruz), ApoAlert Caspase 3荧光检测试剂盒(美国BD Bioscience), AnnexinV-FITC/PI凋亡检测试剂盒 (上海晶美生物技术有限公司),荧光显微镜(日本Olympas),激光共聚焦显微镜、流式细胞仪(美国BIO RAD)。

1.2足细胞培养条件性永生的小鼠足细胞由英国Luigi Gnudi 教授 (King's College London School of Medicine, London, UK) 馈赠,按原始文献方法[3]培养,培养瓶预先经01mg/mL胶原I在37℃处理1h,细胞生长在含10U/mL γ-干扰素,10%胎牛血清,100U/mL青链霉素,100μg/mL链霉素的RPMI1640培养液中,在5%CO2、33℃培养孵箱传代培养。然后转入37℃、5%CO2培养孵箱分化14天后进行实验。

1.3细胞处理及分组生长状态良好的足细胞种植于经胶原I处理的培养板中,当细胞生长至60%～70%时,换1%胎牛血清培养液培养24h同步化, 然后分为:①正常糖对照组(NG):D-葡萄糖5 mmol /L;②高渗对照组(MA):甘露醇25mmol /L+D-葡萄糖5 mmol /L;③高糖刺激组(HG):D-葡萄糖30 mmol /L;④高糖刺激+AS-IV干预组:不同剂量(10、50、100μg/mL)AS-IV干预24h。

1.4细胞凋亡检测 ① 流式细胞仪检测足细胞凋亡率:上述已分化足细胞经同步化处理后,根据不同实验分组处理细胞,然后用预冷磷酸盐缓冲液(PBS)冲洗2次,细胞刀刮下重悬于1×结合缓冲液中,调整待测细胞浓度为1×106个/mL,取100μL细胞悬液加入反应管中,然后分别加入5μL AnnexinV-FITC和5μL碘化丙啶(PI),轻轻混匀,避光室温反应15min,加入400μL 1×结合缓冲液,筛网过滤后用流式细胞仪检测,计算凋亡率。

② Hoechst-33342染色检足细胞凋亡率:上述不同实验组细胞以甲醇、冰乙酸混合液(体积比为3∶1)固定10min,用PBS冲洗两次,加入终浓度为5μg/mL的Hoechst-33342,避光室温孵育30 min,30%缓冲甘油封片。然后在激光扫描共聚焦显微镜下观察,各组随机选取不重叠10个视野计数细胞总数和凋亡细胞,计数200个细胞,计算凋亡细胞占总细胞数的百分比(凋亡率),重复实验3次。

1.5足细胞ROS检测用ROS特异性荧光探针CM-H2-DCF-DA标记细胞ROS水平, 将上述各实验组细胞放入含10μmol/L CM-H2-DCF-DA的PBS中37℃孵化45 min,然后用PBS冲洗并收集细胞,用激光扫描共聚焦显微镜检测ROS水平。

1.6Western印迹分析足细胞p38-MAPK活性 收集上述各实验组细胞以冷PBS洗涤两次后分别裂解细胞,4℃ 15 000r/min离心10 min后留取裂解液上清,用考马斯亮蓝法测定蛋白浓度。以12 %SDS-聚丙烯酰胺凝胶进行电泳分离,电泳完毕后将凝胶上的蛋白电转移至硝酸纤维素膜上。室温下以5%脱脂奶粉封闭, 用抗磷酸化p38MAPK抗体4℃孵育过夜, 然后再与辣根过氧化物酶标记的二抗室温孵育1h, DAB显色。用ECL化学发光剂处理, 胶片曝光, 扫描并定量分析胶片条带的光密度, 重复3次独立实验。

1.7统计学方法计量数据采用±s表示,组间比较采用单因素方差分析,用SPSS 11.0 统计软件分析。P

2结 果

2.1 黄芪甲苷(AS-IV)对高糖诱导的足细胞凋亡的影响

流式细胞仪检测到高糖(HG)刺激24h后足细胞凋亡显著增加(P

注:NG:正常糖对照组; MA:高渗对照组; HG:高糖刺激组

与NG组相比,*P

图1 流式细胞仪(A)及Hoechst-33342染色(B)检测

不同剂量黄芪甲苷(AS-IV)对足细胞凋亡的影响

2.2AS-IV对足细胞ROS水平的影响 与NG组相比,HG组足细胞内ROS水平显著增加(P005), 而AS-IV能呈剂量依赖性减少足细胞ROS水平,在10μg/mL剂量时发挥作用,在100μg/mL剂量时达高峰(P

注:NG:正常糖对照组; MA:高渗对照组; HG:高糖刺激组。

与NG组相比,*P

图2 不同剂量黄芪甲苷(AS-IV)对足细胞ROS水平的影响

2.3AS-IV对足细胞p38-MAPK活性的影响 与NG组相比,HG刺激显著激活p38-MAPK信号通路(P0.05)。而AS-IV能显著抑制高糖诱导的足细胞p38-MAPK活化,其作用呈明显剂量依赖关系,在100μg/mL剂量时作用最显著(P

注:NG:正常糖对照组; MA:高渗对照组; HG:高糖刺激组。

图3 不同剂量黄芪甲苷(AS-IV)对足细胞

p38-MAPK活化的影响

3讨论

DN属中医“消渴”、“水肿”、“尿浊”、“虚劳”等范畴。病位在肝、脾、肾, 基本病机为气阴两虚,并兼夹瘀血、水湿、痰浊等标证。本虚标实、虚实夹杂的病机特点和复杂的病机演化规律决定了DN中医证型的多样化。研究报道[4]认为DN是在“消渴”气阴两虚的基础上发展起来的,气阴虚损、血瘀阻络贯穿本病始终。黄芪有补气升阳,固表止汗,利尿消肿等功效,一直作为治疗DN的常用药物在临床中广泛使用,黄芪甲苷(AS-IV)是黄芪的有效药理成分之一,本研究首次发现AS-IV能明显抑制高糖所致的足细胞凋亡,将为防治早期DN开辟一条新途径。

大量研究表明DN早期就可出现足细胞凋亡,继而加重疾病进展,最近动物实验证实1型及2型DN足细胞凋亡均显著增加[5],且足细胞凋亡比足细胞脱落剥离、微量白蛋白尿及细胞外基质增生发生更早,提示足细胞凋亡是早期DN进展的新机制[1]。笔者采用流式细胞仪及Hoechst染色检测细胞凋亡,均发现黄芪甲苷(AS-IV)能呈剂量依赖性抑制高糖诱导的足细胞凋亡,其中100μg/mL抑制作用最明显,提示AS-IV对高糖诱导的足细胞凋亡具有明确的抑制作用。

氧化应激是引起早期DN进展的重要机制,早期DN产生的氧化应激以形成活性氧(ROS)为特征,现已证实ROS是引起足细胞凋亡的重要因素[1],高糖能直接促进足细胞ROS的产生[6],并通过p38-MAPK信号通路诱导足细胞凋亡[1]。AS-IV具有广泛的药理作用,抗氧化是AS-IV的重要研究领域之一,体内和体外实验均已证实AS-IV有明确抗氧化作用,从而减轻心肌缺血损伤[7]。本研究发现AS-IV呈剂量依赖性抑制高糖诱导的足细胞凋亡及足细胞ROS的产生,提示AS-IV可能通过抗氧化作用抑制足细胞凋亡。

丝裂原激活的蛋白激酶( mitogen active protein kinase, MAPK)信号通路在早期DN足细胞凋亡中的作用越来越受到人们的关注。MAPK是调控细胞生长与凋亡过程的重要信号途径, 包括p38-MAPK、c-Jun-N末端激酶(JNK)、细胞外信号调节激酶(ERK)等主要亚型。细胞外刺激经过激酶级联反应将信号传导至胞核而调控细胞生长和凋亡,在细胞对生长因子和环境应激的反应过程中,MAPK信号通路起关键作用[8],其中p38在细胞凋亡、细胞因子产生、转录调节和细胞骨架重组中起至关重要的作用, p38激活可引起转录、蛋白合成、细胞表面受体表达和细胞骨架结构方面的过度变化,最终导致细胞凋亡[9]。现已证实p38-MAPK信号通路异常激活是导致早期DN足细胞凋亡的关键环节[1]。笔者发现高糖能显著激活p38-MAPK信号通路,而AS-IV能抑制高糖诱导的足细胞p38-MAPK活化,其作用呈明显剂量依赖关系。ROS与MAPK激活之间的关键联系可能与氧化应激通过凋亡信号调节酶-1(apoptosis signalregulatingkinase 1) 激活p38-MAPK有关[10],因此,笔者认为AS-IV缓解高糖诱导的足细胞凋亡的机制与其减少足细胞ROS水平及抑制p38-MAPK的活化密切相关。

综上所述,笔者研究表明中药黄芪的主要药理成分AS-IV能显著缓解高糖所致的足细胞凋亡,其机制可能与AS-IV抗氧化及抑制p38-MAPK活化密切相关,因此,AS-IV可能成为防治早期DN的潜在新型中药单体,值得进一步研究和开发。

参考文献

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