丹参联合骨髓间充质干细胞静脉移植对兔心肌梗死区血管再生影响的实验研究

收稿日期:2009-11-21

基金项目:辽宁省教育厅资助项目(20060553)

作者简介:王健(1969-),女,辽宁大连人,副主任医师,研究方向:中西医结合心血管专业。

通讯作者:陈岩(1965-),女,河北宁河人,主任医师,硕士研究生导师,博士,研究方向:中西医结合临床心血管。

摘 要:目的:探讨骨髓间充质干细胞静脉移植对兔急性心肌梗死(AMI)梗死区及梗死周围区血管新生的影响及中药丹参注射液对其的干预作用。方法:用开胸结扎冠状动脉左室支的方法建立急性心肌梗死模型,将已建立心肌梗死模型的日本大耳白兔随机分为3组,模型对照组、静脉移植骨髓间充质干细胞组、静脉移植骨髓间充值干细胞联合丹参组。术后5周取材,观察梗死区内CD31(血小板/内皮细胞黏附分子)和VEGF(血管内皮生长因子)蛋白的表达。结果:1免疫组化CD31表达,静脉注射干细胞组和干细胞联合静脉注射丹参组高于模型组(P0.05)。3血清中VEGF蛋白含量,各组间无统计学差异(P>0.05)。结论:静脉注射骨髓间充质干细胞可诱导梗死区血管新生,其机制并非通过VEGF的表达来调节的,可能是通过其他途径调节的,中药丹参注射液对干细胞促进血管新生无明显促进作用。

关键词:骨髓间充质干细胞;心肌梗死;血管新生;CD31;VEGF

中图分类号:R285.5 文献标识码:A 文章编号:1673-7717(2010)04-0792-04

The Study of Bone Marrow Stem Cells in Vein Graft Result in Rabbits With Myocardial Infarction on the Role of Its Intervention with Danshen Injection

WANG Jian,YANG Guanlin,CHEN Yan,ZHANG Zhe,ZU Jing,SUI Jifeng

(Affiliated Hospital of Liaoning University of TCM,Shengyang 110032, Liaoning, China)

Abstract:Objective: To investigate bone marrow stem cells in vein graft result in rabbits with acute myocardial infarction (AMI) in peri-infarct area and infarct angiogenesis effect of Chinese medicine Danshen injection on the role of its intervention. Methods: The left ventricular branch coronary artery ligation thoracotomy approach model of acute myocardial infarction, myocardial infarction model will have established a Japanese white rabbits were randomly divided into three groups, model control group, intravenous transplantation of bone marrow mesenchymal stem cell group, Danshen injection combined with intravenous transplantation of bone marrow-derived mesenchymal stem cell group. Drawn after 5 weeks,Infarct area observed CD31 (platelet / endothelial cell adhesion molecule) and VEGF (Vascular Endothelial Growth Factor) protein expression. Results: 1.Immunohistochemical expression of CD31 protein, Intravenous injection of stem cell group and intravenous injection of Danshen injection combined with intravenous injection of stem cell group were higher than model group(P0.05). 3.Serum VEGF protein content Serum VEGF protein content was not statistically significant among the three groups(P>0.05).Conclusion: The intravenous injection of bone marrow mesenchymal stem cells can induce angiogenesis in the infarct area, its mechanism is not adopted to regulate the expression of VEGF, and may be regulated by other means, Chinese medicine Danshen injection of stem cells for no obvious role in promoting angiogenesis.

Key words:bone marrow mesenchymal stem cells;acute myocardial infarction;angiogenesis

心肌梗死是心血管病中最为危重的事件之一,心肌梗死后由于梗死区面积的不同,而影响心功能有所的不同,从而对心肌梗死的预后产生极大的影响。如何使梗死血管所支配区域的血液供应及早充分的恢复,从而使心肌梗死后梗死区的面积减至最小,便成为最为关注的话题。除了使心肌梗死的病变血管恢复血流外,侧枝循环的建立也是抢救濒临坏死心肌的重要手段之一。

丹参是我国的传统活血化瘀中药,味苦、微寒,入心、心包及肝经,具有活血通络、祛瘀止痛、凉血消痈、清心除烦之功效。现已发现具有抑菌、抑肿瘤、抗凝血以及改善微循环等作用[1]。丹参注射液一直用在临床一线治疗心血管系统疾病。

本研究以兔子骨髓间充质干细胞为供体细胞,配合应用丹参注射液旨在探讨兔MSCs静脉移植对急性心肌梗死兔的梗死区血管新生的影响:并进一步研究丹参注射液对其作用的影响。

1 材料与方法

1.1实验动物的选择与分组

动物采用日本大耳白兔,体重在2～3kg,2～3个月龄,雌雄不限,购自于辽宁中医药大学实验动物中心。将53只日本大耳白兔随机分为:正常组(10只),造模组45只,根据复制模型成功率(预实验的最低造模成功率70%计算),将造模组心肌梗死模型复制成功后观察24 h,存活者随机分为B组:模型组(10只),C组:静脉7天注射干细胞组(10只),D组:静脉7天注射干细胞联合丹参组(10只)。组间体重差异无显著性(2.4±0.3)kg、(2.5±0.2)kg、(2.3±0.3)kg、(2.5±0.3)kg,P

1.2 药品与试剂

1.2.1药品 丹参注射液,剂型:冻干粉针剂,规格与包装:0.4g×1支(哈药集团中药二厂)。

1.2.2试剂 乌拉坦,分析纯,4%多聚基甲醛,分析纯,(沈阳试剂二厂);间充质干细胞培养基及间充质干细胞培养基添加物、Ficoll-paque plus、PBS含2%FBS、PBS不含FBS、胰酶-EDTA.培养瓶斜口;离心机;流式细胞仪等。

1.3器材

心肌梗死造模器材:兔手术固定台、心电图机;手术器材包括手术刀、持针器、眼科剪、瓦式拉钩(以上器材均由本校针灸学院电生理实验室提供);无损伤冠脉结扎针线、普通缝合针线等等。

2实验方法

2.1 骨髓间充质干细胞的获得

取健康日本大耳白兔2只,经胫骨平台抽取骨髓,进行间充质干细胞分离、培养、传代、鉴定、收集、标记。

2.2急性心梗动物模型制备

①麻醉;②做术前心电图;③备皮;④开胸;⑤结扎:⑥术后心电图;⑦关胸;⑧抽血。

2.3模型干预

造模成功7天后C组予干细胞混悬液2×106静脉1次性注射。D组予静脉注射丹参注射液(154mg/kg),连续注射10天,联合应用与C组等量的干细胞。

2.4 标本采集

2.4.1 采血 于术后24h和第5周经耳中动脉采血,离心(3000r/min),用于ELASA(夹心酶联免疫)法检测VEGF。

2.4.2 取心脏组织 术后第5周,麻醉动物,于活体下迅速取出心脏。并于30s内迅速切下梗死及梗死周围区心肌组织,用4%多聚甲醛固定以备免疫组化。

2.5观察指标

免疫组化观察:CD31,VEGF的表达;血清学检测VEGF的表达。

2.6阳性结果判定

梗死区组织中有棕褐色阳性细胞聚集区。

2.7统计学方法

所有数据采用±s表示 ,采用单因素方差分析和进行统学处理。应用 SPSS 11.0软件,P

3 结 果

3.1 急性心肌梗死造模结果

结扎冠脉前与结扎冠脉后心电图的比较结果

在结扎兔前降支(LAD)冠脉后,胸前导联V2、V5,ST段有一定程度的抬高,提示前壁心梗,心电图证实急性心梗模型制备成功见图1～2。

图1造模前

图2造模后24h

3.2 免疫组化染色结果

3.2.1CD31染色显示 在光学显微镜下观察可见图3～图6:血管内皮细胞呈棕褐标记,积分光密度值统计分析结果显示:与正常组比较,模型组明显降低有统计学意义(P0.05);与模型组比较,各组均明显高于模型组有统计学差异(P0.05),见表1。

图3 CD31正常组

图4 CD31模型对照组

图5 CD31静脉7天注射干细胞

图6 CD31静脉7天注射干细胞+中药组

3.2.2 VEGF染色 在光学显微镜下观察可见图7~8:各组均有散在的阳性表达,但各组间无统计学意义(P

图7 正常组VEGF

图8 模型组VEGF

表1免疫组化CD31 VEGF(±s )

组别nCD31VEGF

正常组922.63±11.9033.06±23.93

模型组711.28±7.60**■■31.89±18.91

静脉7天注射干细胞组721.20±11.0031.10±21.69

干细胞合并中药组717.78±9.4025.87±18.65

注:与正常对照组比较*P

3.3 血清中VEGF水平

术后5周比较血清中VEGF含量,各组间比较无统计学意义(P>0.05),见表2。

表2 血清VEGF

组别nVEGF

模型组724.60±5.13

静脉7天注射干细胞组724.84±12.81

静脉7天注射干细胞合并中药组729.92±6.27

4 分析讨论

目前急性心肌梗死的治疗是通过药物治疗减少心肌耗氧、扩血管改善心肌血液供应;通过调控危险因素防止病变进展,但无法改善梗死区心肌血供,挽救濒死心肌组织;通过介入或手术治疗恢复局部冠状动脉血流来进行血运重建,使部分AMI患者的临床症状和远期预后得到明显改善,但也有其局限性、手术风险和术后并发症等。因此有必要寻找血运重建的其他策略以减轻AMI的症状和改善心肌缺血,挽救濒死的心肌[2]。

骨髓间质干细胞(MSC)是具有可扩增性和多向分化性。同时MSC来源广泛,移植后不易发生免疫排斥反应[3-5]。自2001年Orlic等[6]发现MSCs可在一定条件下分化为心肌细胞以来,现已明确还具有分化为心肌细胞、血管内皮细胞和平滑肌细胞的潜能。

丹参是我国的传统活血化瘀中药,现已发现具有抑菌、抑肿瘤、抗凝血以及改善微循环等作用[1]。丹参的有效成分主要为水溶性酚酸类物质,由丹参提取物制成的丹参注射液一直用于冠心病的治疗。丹参注射液具有降低毛细血管通透性、改善微循环,保护肺功能,抗氧自由基、抗炎等作用[7]现代医学研究证明,丹参的活血化瘀作用与其具有抑制血小板聚集、抗凝、抗血栓功能有关[8-9]。丹参多酚酸盐可抑制血小板聚集与黏附[10]。

CD31即血小板内皮细胞黏附分子(platelet and endothelial cell adhesion molecule.PECAM-1)在血小板、内皮细胞、单核细胞、嗜中性细胞及某些T细胞亚群上表达的质膜糖蛋白,分子量为130～135kDa,属于球蛋白基因超家族,主要表达在内皮细胞表面,较少表达于造血细胞[11]CD31介导的细胞―细胞相互作用对于血管生成和炎症反应有重要意义[12],可以作为内皮细胞或单核细胞的标志。在本研究采用CD31作为内皮系的标志,具有较高的特异性。与CD31单克隆抗体结合的内皮细胞较远时,属于新生的内皮细胞,因此其免疫组化检测可作为血管再生的标志。

血管内皮细胞生长因子(VEGF),是一种相对分子量为46kDa的分泌性糖蛋白,1989年被分化纯化[13],被认为是一种肝素结合分子。VEGF特意地作用于血管内皮细胞,与其受体结合,引起受体自身磷酸化,激活丝裂原火花的蛋白激酶而强烈诱导细胞增殖,促进体内新生血管形成,增加梗死缺血区心肌的血液供应,挽救濒死心肌。

在本实验中笔者成功地复制了心肌梗死的模型,并在术后给予静脉注射骨髓间充质干细胞、干细胞联合中药丹参静脉注射。CD31免疫组化研究发现,骨髓间充质干细胞组和干细胞联合中药组均可以促进梗死区及其周围区新生毛细血管的生成,以改善微循环,增加梗死区及其周围区的血液供应,从而减少心肌梗死的面积,改善预后。但两组间无统计学差异说明中药丹参对干细胞促进血管新生无促进作用。同时VEGF免疫组化和血清学结果均显示其影响机制并非是通过调节血管内皮细胞生长因子来实现的。

综上所述,静脉注射骨髓间充质干细胞可诱导梗死区血管新生,其机制并非通过VEGF的表达来调节的,可能是通过其他途径调节的,中药丹参注射液对干细胞促进血管新生无明显促进作用。

参考文献

[1] 陈维洲.丹参的药理[J].药学学报, 1984, 19(11):876-878.

[2] Nagaya N , Fujii T,Iwase T,et al. Intravenous administration of mes-enchymal stem cells improves cardiac function in rats with acute myocardialinfarction through angiogenesis and myogenesis [J]. Am J Physiol HeartCirc Physiol,2004,287(6):26702-26761.

[3] Toma C,Pittenger MF,Cahill BS,et al. Human mesenchymal sten cells differ-entiate to a cardiomyocyte phenotype in themurine heart[J].Circulation,2002,105(1):932-981.

[4] Konieczny SF,Emerson CP. Jr15-Azacytidine induction of stable mesoderm-mal stem cell lineage from 10TI/2 cells:evidence for regulatory genescontrolling determination[J].cell,1984 ,38(3):7912-8001.

[5] Saito T ,Bruder SP ,Bittira B,et al. Xenotransplant cardiac chimera : im2mune tolerance ofstem cells[J].Ann Thorac Surg,2002,74 (1):192-241.

[6] Wang JS,Shum-Tim D,Galipeau J,et al.Marrow stromal cells for cellularardiomyoplasty: feasibility and potential clinical advantages[J]. J Thorac Cardiovasc Surg, 2000,120:999-1005.

[7] 杜冠华,张均田.丹参现代研究概况与进展[J].医药导报,2004,23(7):435-439.

[8] 李连达,李映欧,刘志云,等.冠心II号方及其有效成分对体外培养心肌细胞缺糖缺氧损伤的保护作用[M]//陈可冀.活血化瘀研究与临床.北京:北京医科大学中国协和医科大学联合出版社,1999:272-274.

[9] 徐理纳.关于活血化瘀药研究途径的概况[J].中医杂志,1995,7 (2):74-79.

[10] 高辉,李先辉,李春艳,等.丹参多酚酸对健康人血小板聚集与黏附的影响[J].蚌埠医学院学报,2007,32 (5) :514-516.

[11] Wang YJ, Repyak K,Sheibani N,et al.Expression pattern of alternat-ively spliced PECAM-1 isoforms in retinal vasculature[J].Molecular Visi-on,2004,10:103-111.

[12] Sheibani N,Frazier WA.Thrornbospondin-1,PECAM-1,and regulation of angiogenesis[J].Histol Histupathol,1999,14:285-294.

[13] Leung DW,Cachianes G,Kuang WJ.Vascular endothelial growth factor is a secreted angiogenic mitogen[J].Science,1989,246:1306-1309.