金银花中总黄酮的超声波提取工艺优化

摘要：采用超声波法提取了金银花中的总黄酮，通过单因素试验研究了乙醇体积分数、超声温度、超声时间、料液比和超声频率等因素对提取效率的影响。在此基础上，选择乙醇体积分数、超声温度、料液比和超声时间进行L9（34）正交试验，得出了总黄酮的最佳提取工艺参数：乙醇体积分数为70%，超声温度为50℃，料液比为1∶25（g·mL1），超声时间为2.0h，超声功率为900W，最大提取率达到9.37%。

关键词：超声波法；金银花；总黄酮；正交试验

中图分类号：R284.1文献标识码：B文章编号：1674-9944（2013）10-0014-04

1引言

金银花为忍冬科多年生半常绿缠绕植物忍冬（Lonicera japonica Thumb.）、红腺忍冬（L.hypoglaucamiq）、山银花（L.con-fusa DC）或毛花柱忍冬（L.dasystyla Rehd）的干燥花蕾或带初开的花[1，2]。金银花为临床常用中药，具有清热解毒，凉散风热之功效，主治痈肿疗疮、喉痹、丹毒、热毒血痢、风热感冒、温病发势等[3～5]。而黄酮类化合物是金银花的主要成分[6]。现代医学研究表明，黄酮类化合物具有降低心肌耗氧量，使冠脉、脑血管流量增加、抗心律失常、软化血管、降血糖、血脂等作用[7，8]。本文采用超声波提取法对金银花中的黄酮类物质进行提取，通过单因素试验和正交实验，研究金银花中总黄酮的最佳提取工艺，为金银花中有效成分的提取提供理论基础。

2材料与方法

2.1主要仪器和设备

UV-2550型紫外可见分光光度计（日本岛津）；FA1104N 型电子天平（上海菁海）；FW-135 型中草药粉碎机（上海超亿）；TG20-WS型离心机（郑州宏朗）；HN-1000D型超声波萃取仪（上海汗诺）；101-2AB型电热鼓风干燥箱（天津市泰斯特）；60目的筛子。

2.2主要材料和试剂

金银花（四川达州产）；芦丁标准品（上海试剂二厂）；无水乙醇、氢氧化钠、亚硝酸钠、硝酸铝等均为分析纯；实验用水均为二次蒸馏水。

2.3试验方法

2.3.1对照品溶液的制备

准确称取经干燥恒重的芦丁标准品20.0mg，用适量体积分数为30%的乙醇充分溶解，转移至100mL容量瓶中，用体积分数为30%的乙醇定容至刻度，摇匀做对照品储备试液。此试液中芦丁的浓度为0.2mg/mL。

2.3.2标准曲线的绘制

分别精确移取芦丁对照品溶液0、10、20、40、60、80、100mL于7个25mL容量瓶中，分别向其中首先加入30%乙醇溶液至约125mL，再加入5%的NaNO2水溶液07mL，摇匀，放置6min，加入10%的Al（NO3）3水溶液07mL，摇匀，放置6min，后加入1mol·L-1的NaOH水溶液5mL混匀，最后用30%的乙醇定容至刻度，摇匀，放置10min。以第1瓶作空白对照，在最大吸收波长510nm处测定吸光度，用最小二乘法得线性回归方程[9～11]。

233样品中总黄酮的提取及测定

将金银花于40℃下恒温干燥24h后，冷却至室温，然后用粉碎机粉碎（过60目筛）。准确称取05g金银花粉末，加入适量的30%乙醇进行超声提取，将提取液离心，取上层清液于25mL容量瓶中，重复多次，用30%乙醇定容至刻度，再精确移取其溶液5mL于25mL容量瓶中，按232章节中所述方法处理并测定其吸光度，根据回归方程计算提取液浓度，再按下式计算总黄酮提取率[12]。

黄酮提取率（%）=C×V0×V1V2M×100

其中：C表示标准曲线线形方程得提取液样品的总黄酮的浓度（g/L1）；V0表示提取液定容后的体积（L）；V1表示量取提取液样品测定定容的体积（L）；V2表示量取提取液样品测定的体积（L）；M表示所称取的金银花的质量（g）。

2.3.4金银花总黄酮提取单因素试验

精确称取金银花粉末05g，利用超声波法进行提取，离心分离后，测定其吸光度，得到金银花中总黄酮的提取率。试验中通过调整乙醇体积分数、超声温度、超声时间、料液比和超声频率等因素来分析不同因素对总黄酮提取效率的影响[13～16]。

2.3.5金银花总黄酮提取正交试验

根据单因素实验结果选用超声功率900 W固定的情况下，对其余4个因素进行正交试验，L9（34）即三水平四因素模式。其中4个因素分别为乙醇体积分数（A）、超声温度（B）、料液比（C）和超声时间（D）。以总黄酮提取率为指标，进行正交试验，其因素水平见表1。

2.3.6工艺验证试验

准确称取0.5g金银花粉末，依据正交试验结果的最佳工艺条件，按本文的研究方法，提取金银花中的总黄酮，平行实验3次，测定其吸光度，求得金银花中总黄酮的提取率。

3结果与讨论

3.1标准工作曲线的绘制

由图1可知，用最小二乘法得线性回归方程，吸光度与金银花质量浓度之间的关系为：Y=12307X+00035，r=09999。

3.2单因素试验结果分析

3.2.1乙醇体积分数对总黄酮提取率的影响

精确称取金银花粉末5份各0.5g，分别加入体积分数为20、40、60、80、100%的乙醇溶液10mL，在40℃和超声功率为1000W的情况下超声浸提2.0h。从而得到总黄酮提取率与乙醇体积分数的关系，结果如图2所示。

在乙醇体积分数为20%～60%之间，总黄酮的提取率随乙醇浓度增大而增大，并在60%时达到最大值7.4%，之后随乙醇体积分数的增大提取率反而减少。这可能是由于乙醇浓度增大，醇溶性物质竞争溶解，限制了某些黄酮类物质的溶出。

3.2.2超声温度对总黄酮提取率的影响

精确称取金银花粉末6份各0.5 g，分别加入10mL体积分数为60%的乙醇，分别在25、35、45、55、65、75 ℃的条件下，在1000 W的超声功率下超声2.0 h。从而得到总黄酮提取率与超声温度的关系，结果如图3所示。

总黄酮的提取率在55 ℃时达到最大值为7.6%，温度过低不利于总黄酮的浸出，提取率较低，较高的超声温度能促进分子的热运动，使溶剂和提取物之间的交换速度加快，这样更有利于增加总黄酮的浸出。但是温度过高黄酮不稳定，会使黄酮部分分解而被破坏，导致提取率降低。

3.2.3超声时间对总黄酮提取率的影响

精确称取金银花粉末6份各0.5g，分别加入10mL体积分数为60%的乙醇，并在55℃和1000W的超声功率下分别超声0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0h。超声时间对总黄酮提取率的影响结果见图4。

随着超声时间的增加，提取率不断增加，在2.0h时总黄酮提取率达到最大值7.5%，之后再增加超声时间并没有得到较高的提取率。提取时间短总黄酮不能有效溶出，时间过长，其他组分可能大量溶出，同时黄酮长期置于55℃下，稳定性较低的黄酮类物质会被部分氧化或分解，反而影响提取效率。

3.2.4料液比对总黄酮提取率的影响

精确称取金银花粉末6份各05g，选取料液比1∶5、1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30g/mL，乙醇体积分数为60%，超声温度55℃和1000W超声功率下分别超声20h。从而得到总黄酮提取率与料液比的关系。结果如图5所示。

在用溶剂提取时，适当加大料液比，可将更多的被提取物质提取出来。料液比较小时，总黄酮提取不充分，随着料液比的不断增大，总黄酮有效成分的提取率不断增加，但当料液比超过1∶20g/mL时，黄酮的提取率基本趋于稳定，提取率最大值为7.8%。

3.2.5超声功率对总黄酮提取率的影响

精确称取金银花粉末6份各0.5 g，选取300、500、700、900、1100 W的超声功率进行操作。料液比1∶20g/mL，乙醇体积分数为60%和超声温度55℃下分别超声2.0h。超声功率对总黄酮提取率的影响结果见图6。

随着超声功率的增加，其总黄酮的提取率不断增加，但当超声功率达到900W处后提取量趋于稳定。再增加功率对总黄酮的提取量影响不大。从经济的角度考虑其最佳的提取功率取900W为宜，其提取率最大值为7.7%。

3.3正交试验结果分析

利用超声波法提取金银花中总黄酮的正交试验结果见表2。

当以总黄酮的提取率为评价指标时，从上表分析可知：各因素影响总黄酮提取率的主次顺序为C>B>A>D，即料液比、超声温度、乙醇体积分数，其次是超声时间，所以料液比是影响金银花中总黄酮提取量的主要因素。最佳提取工艺为A3B1C3D2，即乙醇体积分数为70%，超声温度为50℃，料液比为1∶25（g/mL），超声时间为2.0h，在此条件下，总黄酮的提取率为8.52%。

3.4验证试验结果分析

按试验确定的最佳提取工艺分别提取，其结果见表3。

由以上实验数据可以看出，在最佳试验工艺条件下，用超声波提取法，提取金银花中的总黄酮，平行试验3次，可得总黄酮的提取率约为9.37%。

4结语

本文通过超声波法提取金银花中的总黄酮，通过单因素试验研究了乙醇体积分数、超声温度、料液比、超声时间和超声功率对总黄酮提取的影响，并采用正交试验确定了总黄酮的最佳提取工艺，即乙醇体积分数为70%，浸提温度为50℃，料液比为1∶25（g/mL），超声时间为2.0h，超声功率为900W，此条件下金银花中总黄酮的提取率可达9.37%。

参考文献：

[1] 国家药典委员会.中华人名共和国药典（2005版第一部）[M].北京：化学工业出版社，2005：152～153.

[2] 中国科学院北京植物研究所.中国高等植物图鉴（第四册）[M].北京：科学出版社，1975：296.

[3] 于生兰，张龙.金银花的研究进展[J].时珍国医国药，2003，12（8）：498.

[4] 邢俊波，李会军，李萍，等.忍冬花蕾化学成分研究[J].中国新药杂志，2002，11（11）：856～859.

[5] 贾霖，黄国清，肖军霞.金银花中黄酮类化合物的提取工艺[J].食品研究与开发，2013，34（9）：41～43.

[6] 邢俊波，李会军，李萍，等.中药金银花质量标准研究一总黄酮的含量测定[J].中国现代应用药学杂志，2002，19（3）：169～170.

[7] 丁利君，吴振辉，蔡创海，等.金银花中黄酮类物质最佳提取工艺研究[J].食品科学，2002，23（2）：62～65.

[8] 梁萱，赵建军，梁永锋.金银花中黄酮提取工艺研究及野生与人工种植金银花中黄酮含量的比较[J].中南药学，2013，11（3）：173～175.

[9] 刘增根，党军，江磊，等.柴达木枸杞叶有效成分高压均质提取及纯化[J].精细化工，2011（4）：350～354.

[10] 李攀登，李金玲，王宏伟，等.鸡树条荚蒾化学成分测定分析[J].人参研究，2009（2）：16～19.

[11] 罗伟强.四种提取柑皮中黄酮化合物的方法比较[J].甘肃化工，2003（1）：25～26.

[12] 唐楷，颜杰，黄新.金银花总黄酮的提取工艺优化及其抑菌作用研究[J].中国食品添加剂，2012，4：154～157.

[13] 李荣，胡成穆，彭磊，等.正交设计研究金银花总黄酮提取工艺[J].安徽医科大学学报，2006，41（4）：410～412.

[14] 吴琼，陈丽娜，代永刚，等.松仁红衣中黄酮类化合物的提取工艺[J].食品研究与开发，2011，32（5）：45～47.

[15] 李晓军，潘宏利，陈花，等.响应曲面法优化超声辅助提取金银花总黄酮[J].陕西师范大学学报，2009，37（2）：81～85.

[16] 杨志学，万顺，张亮君.正交试验优选金银花中总黄酮的最佳提取工艺[J].中国民族医药杂志，2004（1）：186～187.