温度对培养心肌细胞力学特性的影响

摘要： ［目的］ 探讨温度对培养心肌细胞收缩特性的影响。 ［方法］ 通过培养1~3天龄的Wistar大鼠心肌细胞，用光电培养心肌细胞搏动传感器和生理记录仪记录、测定不同温度下心肌细胞的力学特性。 ［结果］ 从37 ℃降低到30 ℃，培养心肌细胞的力学特性逐渐降低，自主收缩频率（beat rate，BR）、主动收缩张力峰值（peak tension，PT）、张力上升最大速度（+dT/dtmax）、张力下降的最大速度（-dT/dtmax）和心肌细胞活动功率（power，P，P=PT×BR）分别降低到37 ℃状态的93.3%、33.6%、31.6%、37.7%和33.6%，39 ℃时其力学特性最高，BR、PT、+dT/dtmax、-dT/dtmax和P分别达到37 ℃状态的109.3%、124.9%、123.1%、128.4%和134%，达到40 ℃时，其力学特性则又降低，上述5项指标分别降低为37 ℃状态的97.4%、91.8%、90.4%、90.3%和90.7%。 ［结论］ 温度可明显影响培养心肌细胞收缩特性。

关键词：温度；心肌细胞；力学特性

文章编号:1006-3617(2007)01-0085-02

中图分类号:R114

文献标识码:A

肌肉的力学特性与环境温度关系密切，许多研究证实离体肌在25 ℃~30 ℃时，收缩特性最好［1］，即收缩的主动张力和收缩、舒张速度最高。温度对自主性收缩的培养心肌细胞力学特性的影响未见报道。本实验用自制的光电培养心肌细胞搏动传感器，观察温度对培养心肌细胞力学特性的影响。

1 材料与方法

1.1 动物、药品和试剂

1~3天龄Wistar大鼠60只，雌雄兼用。实验分5组进行，即37 ℃对照组和4个温度组（30 ℃、35 ℃、39 ℃和40 ℃）。通过显微镜上的恒温调节装置调节温度，每组测试10个样本，显著性检验用配对资料的t检验。

培养基：Medium199，美国Sigma公司。

Hanks液（mmol/L）：NaCl 137，KCl 5.4，MgSO4 0.81，Na2HPO4 0.37，KH2PO4 0.34，CaCl2 1.3，NaHCO3 4.2及Glucose 5.0。粉红0.02 g/L，双蒸亚沸水配制，pH调至7.30，用G6型玻璃滤菌器抽滤灭菌后，4 ℃贮存备用。

D-Hanks酶消化液：胰蛋白酶（1:250，Sigma公司）用无钙-无镁Hanks液配成0.1%溶液，用1 mol/L NaOH调pH到7.3左右，抽滤灭菌后，-20 ℃贮存。

5-溴脱氧尿核苷（Brdu），Fluka公司产品，亚沸水配成10 mmol/L贮存液，醋酸纤维滤膜过滤除菌，-20 ℃保存。

特级新生小牛无支原体血清，56 ℃温育灭活30 min，分装后-20 ℃贮存备用。

含血清培养液组成：M199培养液，青霉素100 U/ml，链霉素100 μg/ml，临用前加入10%小牛血清。

1.2 实验仪器

二氧化碳孵育箱（SHEL-LAB，1824TC，USA）；倒置相差显微镜（Olympus，IMT-2，Japan），配有恒温调节装置（可准确无级调节温度）。心肌细胞搏动传感器：自制、已获专利ZL9316918.X。四道生理记录仪（日本光电公司）。

1.3 心肌细胞培养与心肌细胞力学特性测定

1～3天龄Wistar大鼠，在无菌条件下开胸取出心脏，将心脏放入冷Hanks液中洗去残血，剪成约1 mm3大小的碎块，用5～7 ml D-Hanks液消化酶，在37 ℃磁力搅拌消化10 min，弃上层悬液。随后重复消化5～6次，分别收集各次细胞悬液，加等量含10%小牛血清的M199培养液，离心（1 000 r/min，8 min），弃上清液，用培养液吹散沉淀细胞，同条件下再次离心，沉淀用10%小牛血清培养液制成细胞悬液，装入100 ml培养瓶。在37℃、5% CO2

2 实验结果

2.1 不同温度致心肌细胞力学特性的变化

从37 ℃依次降低为35 ℃和30 ℃，心肌细胞的收缩活动逐渐降低，部分细胞在30 ℃时，仅有微弱收缩或收缩停止。所测各指标与对照组（37 ℃）相比，均有显著降低（P < 0.05）。从表1见到，当温度升高至39 ℃时，心肌细胞的各项力学指标均比37 ℃时的指标明显升高。当温度升高至40 ℃时，心肌细胞的各项力学指标反而比37 ℃时的指标下降。部分心肌细胞在40 ℃下持续30 min后，各项力学指标产生不可逆的降低。

2.2 不同温度下心肌细胞力学特性的变化曲线

培养心肌细胞的自主收缩频率和力学特性在在30 ℃～39 ℃的范围内呈线性升高，从39 ℃～40 ℃则呈线性降低（见图1）。

3 讨论

从结果可以看出，在30 ℃～39 ℃的范围内，随温度的升高培养心肌细胞的力学特性逐渐增高，达到40 ℃时，反而降低。温度的改变主要影响PT、±dT/dtmax和P，对收缩频率的影响相对较小。这一结果与离体肌上所测结果不一致［3］，可能是本实验所用细胞是自主收缩，而离体肌是用电刺激的方法使其收缩。STEPHENSON等［4］的实验提示离体肌在22 ℃时，收缩张力和收缩速度最高，是由于在此温度时，Ca2+的敏感性最高；在蟾蜍离体腓肠肌实验得到类似的结果［5］。本实验的结果可能是主动收缩的，与相关酶的活性有关，而多数酶的活性在一定范围内与温度呈正变关系。温度对离体培养心肌细胞自主收缩特性与离体肌电刺激收缩特性的差异机制有待进一步研究。

实验发现，温度稍有变化，心肌细胞的收缩功率即产生明显的改变，提示用收缩的功率（PT×BR）来衡量力学特性，是一个非常稳定而灵敏的指标，作为力学特性的指标，具有推广价值。

本文中所涉及到的图表、注解、公式等内容请以PDF格式阅读原文。