硫酸盐还原菌类群分离培养和PCR分析鉴定

摘要： ［目的］ 探讨分离培养和聚合酶链反应（PCR）在硫酸盐还原菌类群分析鉴定中的应用。 ［方法］ 采用分离培养和PCR对贵州阿哈湖沉积物中硫酸盐还原菌类群进行分析，并对分离纯化的一株硫酸盐还原菌进行鉴定。 ［结果］ 贵州阿哈湖沉积物硫酸盐还原菌类群为脱硫肠菌属、脱硫叶菌属和脱硫球菌-脱硫线菌-脱硫八叠菌属；纯化菌株经PCR扩增初步鉴定为脱硫叶菌属，菌株形态与鉴定结果相符。 ［结论］ 采用分离培养结合PCR，可以对硫酸盐还原菌类群进行分析和鉴定。

关键词：分离培养；聚合酶链反应；硫酸盐还原菌

文章编号:1006-3617(2007)01-0040-03

中图分类号:R117

文献标识码:A

硫酸盐还原菌（sulfate-reducing bacteria，SRB）是一类严格厌氧菌，其在代谢活动中可以利用硫酸盐作为电子受体并产生高浓度 H2S。研究环境中硫酸盐还原菌类群和分子生物学特征变化，对认识全球和局部区域环境的硫循环规律、生态系统对酸雨的响应机制以及重金属等环境污染物迁移转化有着重要的理论意义和实际应用价［1～3］。

硫酸盐还原菌类群分析鉴定方法主要有传统学分类［4，5］和分子生物学分类［6～8］，各有不同的优缺点。我们利用分离培养和PCR扩增对贵州阿哈湖沉积物进行了硫酸盐还原菌类群分析，并将一株纯化的硫酸盐还原菌初步鉴定为脱硫叶菌属，菌株形态学特征也符合该类群。本文目的在于优化硫酸盐还原菌分离培养条件，探讨分离培养和PCR扩增对硫酸盐还原菌类群分析和鉴定的可行性。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 硫酸盐还原菌培养基 乳酸2.5 ml，Na2SO4 1.0 g，NH4Cl 1.0 g，CaCl2 0.1 g，K2HPO4 0.5 g，（NH4）2SO4 0.5 g，酵母膏1.0 g，L-半胱氨酸0.6 g，0.1%刃天青1 ml，FeSO4 2.5 g；硫酸盐还原菌固体培养基加入2%琼脂。

1.1.2 主要试剂 Taq DNA聚合酶、dNTP、DNA Marker和引物均为华美公司产品提供或合成，电泳用琼脂糖购于Shanghai Yito公司。

1.1.3 仪器 超净工作台（苏州安泰公司，SW-CJ-1F型）；PCR梯度扩增仪（美国Bio-Rad公司）；DNA定量仪（美国Beckman公司，640型）；凝胶成像及分析系统（美国Bio-Rad公司，75S02580型）；Bbo3-A厌氧菌培养罐（北京百信生物技术有限公司）；氮气手套箱（美国Fisher公司）；沉积物-水界面采样装置为本研究所参考他人研究结果［9］自制。

1.2 方法

1.2.1 样品采集 利用湖泊沉积物-水界面采样装置，采取贵州阿哈湖湖水深21 cm处沉积物。立即于氮气手套箱中，按1 cm距离将柱芯沉积物分样，分样后迅速将样品带至实验室处理。取沉积物柱芯7 cm处样品，进行硫酸盐还原菌分离纯化培养。

1.2.2 硫酸盐还原菌分离纯化培养 接种适量沉积物于硫酸盐还原菌液体培养基中，32 ℃厌氧条件富集培养5 d；取富集液接种于硫酸盐还原菌固体培养基，32 ℃厌氧条件分离培养3 d；接种优势的黑色菌落于固体培养基，32 ℃厌氧条件纯化培养3 d；接种纯化细菌菌落于液体培养基中，32 ℃厌氧条件液体增菌培养3 d。

1.2.3 菌体染色及形态特征观察 参见文献［10］对纯化菌株分别进行革兰染色、鞭毛染色和芽孢染色。

1.2.4 DNA提取 采用酚-氯仿法对分离培养、纯化培养菌落和液体增菌液，分别进行细菌DNA提取。

1.2.5 PCR扩增 应用依据硫酸盐还原菌6个类群16SrDNA保守区设计的6对特异性引物［8］（表1），分别进行硫酸盐还原菌6个类群的PCR扩增。PCR扩增均为30个循环，退火温度为52～58 ℃。每个反应体系中含10 mmol/L Tris-HCl（pH 8.3），50 mmol/L KCl，2.5 mmol/L MgCl2，2 U Taq DNA聚合酶，0.4 μmol/L上下游引物，0.2 mmol/L dNTP，0.2 μg DNA模板。PCR产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳鉴定。每次PCR均设待扩增类群纯培养为阳性对照，大肠埃希菌（ATCC 8099）为阴性对照。

2 结果

2.1 分离、纯化培养和纯化菌株形态特征观察

样品富集后进行固体培养基分离培养，3 d后培养基上出现大小不等的黑色菌落，即为不同类群硫酸盐还原菌菌落。对硫酸盐还原菌优势菌进行纯化培养后，得到中等大小、黑色、光滑的椭圆形菌落（图 1）；纯化菌株镜下形态为G+球菌，菌体呈卵圆形，多成对分布，单鞭毛，无芽孢，形态符合脱硫叶菌属（Desulfobulbus）［11］。

2.2 PCR分析结果

分离培养DNA提取物分别经6个类群硫酸盐还原菌的PCR扩增后，脱硫肠菌属、脱硫叶菌属和脱硫球菌-脱硫线菌-脱硫八叠菌属均有特异性目的片段出现；纯化培养和液体增菌液DNA提取物的PCR，只有脱硫叶菌属有特异性目的片段出现；每次PCR阳性对照均有特异性目的片段，阴性对照为阴性扩增（图2～图4）。表明该层沉积物中有脱硫肠菌属、脱硫叶菌属和脱硫球菌-脱硫线菌-脱硫八叠菌属；根据PCR扩增结果和纯化培养菌落特点、菌体染色及形态学特征将纯化菌株初步鉴定为脱硫叶菌属。

3 讨论

依据硫酸盐还原菌16SrDNA构建的系统发生树，将硫酸盐还原菌分为6个主要类群：脱硫肠菌属（Desulfotomaculum）（类群1）、脱硫叶菌属（Desulfobubus）（类群2）、脱硫杆菌属（Desulfobacterium）（类群3）、脱硫细菌属（Desulfobacter）（类群4）、脱硫球菌-脱硫线菌-脱硫八叠菌属（Desulfococcus-Desulfonema-Desulfosarcina）（类群5）和脱硫弧菌 -脱硫微菌属（Desulfovibrio-Desulfomicrobium）（类群6）。国内部分实验室对硫酸盐还原菌类群分析鉴定，仍采用建立在对菌株的形态特征和生理生化特性基础上的传统学分类法［4］。该法操作复杂且由于菌株变异，使分析鉴定结果准确性和重复性较差，同时由于要求培养条件的苛刻，实验室获得其硫酸还原菌的纯化培养也较为困难。利用依据硫酸还原菌16SrDNA保守区设计的引物而进行的PCR扩增，可以对硫酸盐还原菌类群进行准确分析［8，12］，但该类方法多采用直接从环境中提取DNA，使DNA提取物的纯度和完整性较差，也不利于菌株的进一步分析研究。

我们优化了硫酸盐还原菌的分离纯化方法，利用硫酸盐还原菌在分解硫酸盐的过程中产生高浓度的H2S可以与Fe2+作用形成黑色FeS沉淀，使其在选择性培养基上形成黑色菌落，并获得硫酸盐还原菌的纯化培养。同时进一步利用PCR扩增对分离纯化的硫酸盐还原菌进行了类群分析鉴定。结果表明贵州阿哈湖沉积物7 cm处是硫酸盐还原菌较为活跃的沉积层，该层沉积物有脱硫肠菌属、脱硫叶菌属和脱硫球菌-脱硫线菌-脱硫八叠菌属的存在；纯化的硫酸盐还原菌菌株初步鉴定为脱硫叶菌属，菌体形态学特征亦支持该结论。利用分离培养和PCR技术对硫酸盐还原菌类群进行分析鉴定，克服了传统学分类的操作复杂、结果不稳定性等缺点，具有可靠、省时和操作简单等优势，并有利于纯化菌株的进一步分析。

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