先天性心脏病相关肺动脉高压患儿血microRNAs表达的初步研究

【摘要】 目的 探讨先天性心脏病相关肺动脉高压患儿外周血miR-100及miR-125b的表达及其意义。方法术中抽取实验组和对照组患儿深静脉血液标本并提取总RNA。RT-qPCR法检测患儿血清中miR-100和miR-125b的相对表达量，采用t检验进行统计分析。结果 miR?-125b在实验组患儿血清中的相对表达量为5.975±1.176，是对照组的1.92倍（P<0.05）;而miR?-100在实验组的相对表达量与对照组比无显著差异（P>0.05）。结论 先天性心脏病相关肺动脉高压的患儿血清中miR?-125b的表达显著增高，与肺动脉压力水平呈正相关。

【关键词】先天性心脏病;肺动脉高压;microRNAs

肺动脉高压（PAH，pulmonary arterial hypertension）是一种以肺血管阻力进行性增加为主要改变的疾病，也是由左向右分流型先天性心脏病（CHD）最常见的并发症之一，且缺乏特异的临床症状和典型体征。PAH的形成对CHD的预后有着严重影响，当病情进展为重度肺动脉高压时，预后差死亡率高，患儿往往死于右心功能衰竭。

microRNAs（miRNAs）是一类长度不超过25个核苷酸的单链非编码小RNA分子，在转录后水平负性调控基因的表达[1]。近年来随着miRNAs在心脏发育及先天性心脏病的发生发展中功能的逐步阐明，以及miRNAs的检测手段的日渐成熟，人们在心血管疾病的miRNAs标志物的发掘取得了突破性的进展。

为了探索肺动脉高压患儿血液循环中miRNAs的表达情况，我们选择miR-100及miR-125b作为待检指标，选用RT-qPCR法检测肺动脉高压患儿循环血液中miRNAs的表达情况，为肺动脉高压的临床早期诊断以及生物治疗靶点的探索提供参考。

材料与方法

1. 材料：选择2012年10月-2014年5月期间我科手术治疗40例1-6岁年龄匹配的室间隔缺损患儿，以术中检测的平均肺动脉压力（mPAP mean pulmonary artery pressure）将患儿分为2组：PAH组与对照组。PAH组：室间隔缺损伴重度肺动脉高压患儿20例，mPAP>50mmHg;对照组：室间隔缺损不伴肺动脉高压20例，mPAP

2. 方法：

2.1 血液标本的采集 所有血液均为手术治疗时，麻醉后由深静脉抽取血液5ml，离心提取血清装于EP管中，冻存于-80℃冰箱保存待用。

2.2 总RNA的提取及质量判定 采用Trizol?试剂提取总RNA，具体方法按照说明书执行。使用核酸定量仪NanoDrop1000对抽提出的RNA进行定量检测，并用甲醛变性凝胶电泳检测RNA纯度及完整性。RNA样品A260/280应在1.8-2.0之间。

2.3 RT-qPCR检测

2.3.1 引物设计 RT-qPCR引物序列由中美泰和生物技术（北京）有限公司设计合成。

2.3.2 RT-qPCR 严格按照PrimeScript? RT reagent kit说明书步骤将500ng各组样本总RNA反转录为第一链cDNA。反转录完成后，取2L第一链cDNA为模板，以U6作为内参，加入下述组份：SYBR? Premix Ex TaqTM 染料10L，正反向引物（10mol/L）各0.2L，加水补足为总量20L反应体系后进行PCR扩增，每个检测样本做3个副孔。将加好样品的96孔板放入real-time RT-qPCR仪中，设置程序并开始反应。反应完成后将PCR产物纯化，连接到T载体送测序鉴定。

2.4 统计学方法 RT-qPCR所得相对表达量数值使用SPSS17.0统计学软件进行处理。计量资料以均数±标准差（±s）表示，采用t检验进行统计分析，P<0.05认为差异有统计学意义。

结果

1 总RNA的质量 对抽提的各组样本的RNA用NanoDrop1000核酸定量仪定量，OD260/280值在1.8～2.0范围内。甲醛凝胶电泳条带清晰，样品RNA的28s/18s条带灰度比值≥1.8为质量合格。

2 RT-qPCR 分别用miR-100、miR-125b和内参U6的特异引物扩增对应的目的片段，检测其在实验组和对照组中的表达。结果显示，所有检测指标的扩增曲线无非特异荧光，均一性好。熔解曲线呈单一峰，无杂峰信号出现，产物特异度较好。其中miR-125b在实验组中的Ct值为19.29±0.23，熔解温度为79℃。用2-Ct法将所得Ct值转换成其相对表达量为5.975±1.176，是对照组的1.92倍，差异有统计学意义（P<0.05）。而miR-100的相对含量在两组之间无显著差异，P>0.05。

讨论

已有研究证实，人类miRNAs大约只占人体内总基因的0.5%-1.5%，却能调控大约人体内30%的基因转录[2]。这种现象可能是因为每一个成熟miRNAs的5’端种子区域可以和几十甚至几百种下游靶mRNA的3’UTR相互结合并且抑制其表达。而同一个mRNAs也可以被多个上游的miRNAs所调节，这样就形成了一个庞大而又极其复杂的调节网络[3]。近年来大量的研究表明多达数十种miRNAs特异性地表达于心肌细胞，在心血管疾病中发挥重要作用。

先天性心脏病由左向右分流可以导致肺部高血流剪切力，肺部缺氧及肺部感染等。目前认为肺动脉高压是一种血管增殖性疾病，以肺动脉平滑肌细胞（PASMCs）的增生增加和凋亡减少为主要特征。miRNAs可能参与了肺动脉高压血管重构起到促血管生成的作用。我们利用实时定量PCR检测miR-125b的表达量，发现实验组与对照组之间存在显著的差异，此结果提示，miRNAs与继发于CHD的肺动脉高压的发生发展密切相关，其可能调节肺血管平滑肌异常增殖，参与肺血管的重构，其具体分子机制还有待于进一步发掘。

参考文献 Bartel DP. MicroRNAs： genomics， biogenesis， mechanism， and function[J]. Cell， 2004， 116（2）： 281-97. Shi Y， Jin Y， MicroRNA in cell differentiation and development[J]， Sci China Life Sci， 2009， 52（3）： 205-211. Du T， Zamore PD， Beginning to understand microRNA function[J]， Cell Res， 2007， 17（8）： 661-663.

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