一种新型的儿茶酚―O位―甲基转移酶抑制剂对帕金森大鼠结肠动力及离子转运的影响

摘要：目的 研究一种新型的儿茶酚-O位-甲基转移酶抑制剂对帕金森病大鼠远端结肠平滑肌动力及上皮离子转运的影响，探讨其引起腹泻、便秘、腹痛等胃肠道副作用的可能机理。方法 利用离体帕金森病模型大鼠结肠平滑肌和粘膜标本，采用胃肠道平滑肌动力记录技术、短路电流测定技术测定平滑肌的收缩舒张以及粘膜上皮的离子转运。结果 发现新型抑制剂恩他卡朋对正常大鼠的平滑肌没有作用，但对帕金森病大鼠纵行肌的收缩具有抑制效应，并呈现剂量依赖性的特征，而对环形肌则没有明显的影响。在正常鼠和帕金森病模型大鼠结肠粘膜的基底侧加入恩他卡朋（250？滋M），引起的短路电流（ISC）分别为52.82± 5.86 ？滋A/cm2和 37.69 ± 8.91？滋A/cm2，帕金森模型组和正常组相比，均值降低；在结肠粘膜的基底侧加入恩他卡朋（250？滋M），正常大鼠和模型大鼠的跨膜电阻分别为：46.29 ± 3.949 Ω・cm2 和 49.10 ± 6.385 Ω・cm2 。模型大鼠和正常组相比，跨膜电阻均值略有增加，但无统计学差异。结论 新型抑制剂恩他卡朋对帕金森病大鼠纵行肌的收缩呈现剂量依赖性的抑制效应，并且可以引起帕金森病大鼠远端结肠上皮跨膜短路电流的降低。这些变化可能是造成服用恩他卡朋的患者产生腹泻、便秘等胃肠道副作用的可能机理之一。

关键词：新型的儿茶酚-O位；甲基转移酶抑制剂；帕金森病

左旋多巴是治疗帕金森病最有效的药物，但帕金森患者应用其治疗3～5年后，多数患者出现诸如疗效减退及并发症[1，2]，恩他卡朋是克服这些问题的新药，是一种治疗帕金森病有效的儿茶酚-O位-甲基转移酶（COMT）抑制剂，但应用恩他卡朋后患者会出现明显的胃肠道副作用，特别是腹泻，或者有些则表现为便秘、腹痛，恩他卡朋引起胃肠道不良反应的确切机制尚不明确[3～5]。

我们推测恩他卡朋之所以引起帕金森病患者胃肠道不良反应，可能与其影响了肠道平滑肌动力变化，甚或影响了肠道上皮的相关离子转运有关，恩他卡朋影响帕金森病患者肠道上皮以及平滑肌动力改变的机制未有文献报道。基于此种情形，本实验观察了恩他卡朋对帕金森病模型大鼠离体结肠平滑肌的作用，以及其对大鼠远端结肠上皮离子转运影响，探究其造成帕金森病患者应用恩他卡朋造成肠道不良反应的主要原因，对预防和应对这些副作用提供实验依据。

1资料与方法

1.1 实验动物 SPF级雄性SD大鼠，体重200～300g，随机分组，按照实验动物福利委员会许可，动物在室温条件下，正常昼夜更替的光照，24h食水供应，直至试验之日。动物来源于首都医科大学动物科学部，国家等级动物饲养场。

1.2 主要试剂和配制 恩他卡朋为芬兰公司产品（Orion Corporation），所有化学试剂均溶于二甲基亚砜（dimethyl sulfoxide，DMSO），且DMSO的体积分数不超过0.1%。预实验表明，溶剂不改变基本的电生理参数。

1.3 大鼠结肠平滑肌收缩的记录 大鼠断颈处死后，切开腹部，快速取邻近7cm长的远端结肠，用Kreb，s冲洗肠内容物，取远端结肠第一段到第四段（DC1-DC4），每一段沿肠系膜剪开，腔面膜朝下平铺于硅胶上，周围有冰冷的Kreb，s保持组织活性。全层的结肠沿纵行肌或环形肌剪成 2 mm宽，1～1.5 cm长的肌条，用外科缝线在肌条的两端各缝扎一细线，一端固定在标本支持棒上，另一端挂于压力传感器。肌条置于盛有恒温（37 ± 0.5℃）、持续通气（95%氧气与5%二氧化碳）10 mL的Kreb's里内。给肌条施加1g的静息张力，肌条长度的改变被张力传感器所记录，肌条在水浴中适应120min后，正式记录自发收缩的频率以及幅度。

1.4 用于测量短路电流的组织制备 大鼠远端结肠粘膜标本制备：用颈椎脱臼法处死大鼠，打开腹腔，迅速从直肠淋巴结向上取约7cm远端结肠（该淋巴结通常位于直肠向上约3 cm处）。用顶端精细的镊子，在解剖显微镜下，小心将粘膜下层肌层和浆膜层与粘膜层钝性分离，得到一薄层组织，包括上皮层和一些粘连的结缔组织，大鼠远端结肠粘膜标本即制备完成。

1.5 短路电流测定技术 本实验采用恒温灌流装置体外测量短路电流，将结肠粘膜标本置于灌流装置的Ussing小室中。在结肠粘膜的两侧注入5 ml K-HS，同时通入95%的氧和5%的二氧化碳，使溶液的pH维持在7.4左右，置于37℃水浴中30min，使其电参数达到稳定。用电压钳将上皮固定在零电位，使组织短路，此时测得跨上皮电流为短路电流。

1.6 大鼠PD模型的制作 选取雄性SD大鼠，体重210～240 g。首先称量体重，并按每100 g体重0.4 ml注射10%水合氯醛麻醉大鼠。将动物固定于立体定位仪上，根据图谱坐标前囟后5.6 mm，旁开2 mm，即AP=-5.6 mm （囟后为负，囟前为正），ML=±2 mm （右为负，左为正）调整坐标杆，用记号笔打记号。4 μl 6-OHDA（2 μg/μl），总量为8 μg 匀速进药，1 μl/min，留针2min。缓慢上升针头，沾少量生理盐水湿润切口，用生理盐水浸泡明胶海绵，挤干后封孔，撒少量青霉素粉末，缝合皮肤，腹腔注射青霉素（0.5 ml/只）。正常对照组注射生理盐水，其他与模型组相同。

1.7 统计学分析 应用GraphPad Prism 4.0软件进行统计处理，数据以（x ± s）表示。

2结果

2.1 恩他卡朋对帕金森模型大鼠结肠平滑肌动力的影响 分别应用恩他卡朋 2？滋M 、20？滋M、100？滋M、200？滋M、400？滋M，观察恩他卡朋对帕金森模型大鼠远端结肠纵行肌的影响，见图1， 可见纵行肌的收缩幅度由基础值1233 ± 50.13 mg 分别下降到 1150 ± 64.96 mg、859.9 ± 43.54 mg、566.8 ± 92.6 mg、311.6 ± 74.86 mg 和 304.9 ± 53.7 mg。提示恩他卡朋对结肠纵行肌的收缩有抑制效应，并呈现剂量依赖性的特征。而不同剂量的恩他卡朋对帕金森模型大鼠远端结肠的环形肌，以及对正常大鼠的纵行肌和环形肌均无影响（数据结果未显示）。

图1 恩他卡朋对帕金森大鼠结肠平滑肌动力的影响。

分别加入恩他卡朋 2？滋M、20？滋M、100 ？滋M、200 ？滋M、400？滋M，对结肠纵行肌收缩的抑制效应（n = 6）。数据用x±s表示。

2.2 恩他卡朋对帕金森模型大鼠结肠粘膜ISC变化的影响 见图2，在正常大鼠和帕金森模型大鼠，在结肠粘膜的基底侧加入恩他卡朋（250？滋M），引起的ISC分别为52.82± 5.86？滋A/cm2和37.69 ± 8.91？滋A/cm2，帕金森模型组和对照组相比，均值降低（见图2A）；在结肠粘膜的基底侧加入恩他卡朋（250？滋M），正常大鼠和帕金森PD模型大鼠的跨膜电阻分别为：46.29 ± 3.949 Ω・cm2 和 49.10 ± 6.385 Ω・cm2 ，帕金森组和正常组相比，跨膜电阻均值略有增加，但无统计学差异（见图2B）。

图2 恩他卡朋在正常大鼠和帕金森模型模型大鼠诱发的ISC反应

（A） 基底侧加入恩他卡朋，正常大鼠和帕金森模型模型大鼠诱发的ISC反应。（B） 基底侧加入恩他卡朋，正常大鼠和帕金森模型模型大鼠跨膜电阻的改变。

3讨论

在年龄65岁以上的人群中，有超过1%的比例受到帕金森病的影响。到目前为止，左旋多巴仍是帕金森病最有效的治疗药物。但是对于重症晚期患者，或者应用左旋多巴治疗3～5年后的患者，大多数会出现诸如疗效减退、异动症等"长期综合征"。目前临床研究和使用证实，作为一种有效的、选择性的、可逆的和作用于外周的儿茶酚-O位-甲基转移酶抑制剂，恩他卡朋对治疗帕金森病具有突出的临床意义。恩他卡朋如果和左旋多巴/卡比多巴合并使用，可显著改善帕金森病患者的临床症状，作为新药的恩他卡朋尽管颇有前景，但其副作用也比较常见。在胃肠道症状中，腹泻尤为突出，恩他卡朋也可引起便秘和腹痛，有1%的患者因腹痛而中断恩他卡朋的治疗。中断使用恩他卡朋数天后腹泻等胃肠道不良反应可以得到改善，机制不清。腹痛可以严重到中等程度，服用大剂量（>1600mg/d） 恩他卡朋时腹痛发生率和严重程度更高，原因未明[6]。

在对恩他卡朋诱发的副作用研究中，本文应用正常大鼠急性实验，探讨了恩他卡朋引起帕金森模型大鼠的副作用机制。本实验结果提示恩他卡朋对结肠纵行肌的收缩有抑制效应，并呈现剂量依赖性的特征。这可能会引起帕金森患者胃肠道平滑肌收缩和舒张的紊乱，出现动力障碍，肠腔内容物传输处理受限，形成部分患者便秘。在结肠粘膜的基底侧加入恩他卡朋诱发跨粘膜上皮的短路电流，发现帕金森模型大鼠的基短路电流与对照组相比降低，提示恩他卡朋对帕金森模型大鼠结肠的离子转运整体上看呈现偏弱的态势，可能与恩他卡朋引发患者副作用想关。

今后可以考虑以下几个方面的深入研究：①观察应用恩他卡朋后的慢性实验。因为临床上患者服用恩他卡朋的时间比较长。②与目前临床上一些典型的止泻药物相对照研究，提供更多的临床应用依据。③肠神经系统在粘膜促分泌与平滑肌收缩之间的协同调控作用，应该是进一步研究的着力点之一。

参考文献：

[1] Stoessl AJ. Continuous dopaminergic therapy in Parkinson disease： time to stride back[J].Ann Neurol，2010，68：3-5.

[2] Stocchi F， Rascol O， Kieburtz K，et al. Initiating levodopa/carbidopa therapy with and without entacapone in early Parkinson disease： the STRIDE-PD study[J].Ann Neurol，2010，68：18-27.

[3] Delea TE， Thomas SK， Hagiwara M， et al. Adherence with levodopa/carbidopa/entacapone versus levodopa/carbidopa and entacapone as separate tablets in patients with Parkinson's disease[J].Curr Med Res Opin，2010，26：1543-1552.

[4] LeWitt PA， Jennings D， Lyons KE，et al. Pharmacokinetic-pharmacodynamic crossover comparison of two levodopa extension strategies[J].Mov Disord，2009，24：1319-1324.

[5] Holtzer R， Ozelius L， Xue X，et al. Differential effects of COMT on gait and executive control in aging[J].Neurobiol Aging，2010，31： 523-531.

[6] Antonini A， Chaudhuri KR， Martinez-Martin，et al. Oral and infusion levodopa-based strategies for managing motor complications in patients with Parkinson's disease[J].CNS Drug， 2010，24：119-129.