基于曲线拟合的蚕豆病害叶的FTIR研究

摘要：用傅里叶变换红外光谱法研究蚕豆病害叶片，结果显示不同病害蚕豆叶片红外光谱图整体相似，它们的红外光谱主要由蛋白质、脂类和多糖的振动吸收带组成，仅在1 800～1 300 cm-1范围光谱的峰位、峰形及吸收强度有一些微小差异。对1 800～1 300 cm-1波数范围的光谱图进行二阶导数处理，结果显示蚕豆病害叶的二阶导数谱差异明显。对健康和病害蚕豆叶1 700～1 500 cm-1范围光谱进行傅里叶自去卷积和曲线拟合处理后，得到蛋白质酰胺Ⅱ带（1 550 cm-1）、木质素（1 605 cm-1）和酰胺I（1 650 cm-1）3个子峰，相应子峰的峰面积比例显示差异，黄化卷叶病分别为24.01%、36.55%、39.44%，赤斑病分别为15.42%、42.98%、41.61%，轮纹病分别为32.39%、35.63%、31.98%，锈病分别为13.97%、46.40%、39.65%，健康叶片分别为38.86%、28.68%、32.47%，健康叶的酰胺Ⅱ带子峰相对面积比病害叶的大，而其木质素子峰相对面积比病害叶的小。对于子峰面积比A1 563/A1 605、A1 650/A1 605和A1 563/A1 654，4种病害叶的比值均比健康叶的相应数值小，4种病害叶之间也有差异。结果表明傅里叶变换红外光谱（FTIR）结合曲线拟合可望对不同病害的样品进行有效鉴别。

关键词：傅里叶变换红外光谱；蚕豆病害；二阶导数光谱；曲线拟合

中图分类号：O657.33；S435.23 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2014）17-4182-04

Curve-fitting Based FTIR of Diseased Leaves in Broad Bean

WANG Xiao-hua1a， LIU Gang1a， OU Quan-hong1a， ZHOU Xiang-ping1a， HAO Jian-ming1a，

Lu Jian-hong1b， WANG Lu-xiang2

（1a. School of Physics and Electronic Information；1b. Key Laboratory of Advanced Technique & Preparation for Renewable Energy Materials， Ministry of Education， Yunnan Normal University， Kunming 650092， China；

2. Institute of Quality Standards and Testing Technology， Yunnan Academy of Agricultural Sciences， Kunming 650223， China）

Abstract： Fourier transform infrared （FTIR） method was used to study diseased leaves in broad bean. Results showed that the infrared spectra of broad bean leaves were similar and mainly made up of the absorption bands of protein， lipid and polysaccharides. There were minor differences including the spectral peak position， peak shape and the absorption intensity in the range of 1 800～1 300 cm-1. There were obvious differences among their second derivative spectra in the range of 1 800～1 300 cm-1. After the procedure of the Fourier self-deconvolution and curve fitting of health bean leaf and broad bean diseased leaves in the range of 1 700～1 500 cm-1， three peaks were obtained at 1 560 cm-1 （amide Ⅱ）， 1 605 cm-1（lignin） and 1 650 cm-1 （protein amide I）. The ratios of relative areas of the bands of amide Ⅱ， lignin， and amide I were 38.86%， 28.68% and 32.47% in the spectrum of healthy leaf， respectively. It was distinguished from the diseased leaves （red spot leaf： 15.42%， 42.98% and 41.61%， ring spot leaf： 32.39%， 35.63% and 31.98%， rust leaf： 13.94%， 46.40% and 39.65%， yellowing leaf curl disease leaf： 24.01%， 36.55% and 39.44%）. For sub-band area ratios A1563/A1605， A1650/A1605 and A1563/A1654， those of four kinds of diseased leaves were smaller than that of healthy leaf. The results proved that FTIR combined with curve fitting might be a potentially useful tool for detecting different kinds of broad bean diseases.

Key words： Fourier transform infrared （FTIR） spectroscopy； broad bean diseases； second derivative spectra； curve fitting

蚕豆又名胡豆、佛豆、川豆、罗汉豆，一年生或者两年生草本植物，为粮食、蔬菜和饲料、绿肥兼用作物，起源于西南亚和北非。蚕豆含有8种必需氨基酸，碳水化合物含量47%～60%，营养价值丰富，含有丰富的钙、蛋白质、磷脂，不含有胆固醇，有益人体健康。嫩蚕豆具和胃、润肠通便功效，蚕豆茎有止血、止泻功能；蚕豆花具有降压、止带、止血之功效[1]。

蚕豆产量、质量受病虫害影响，病害以真菌性病害和病毒居多。叶部病害多为各种叶斑病，例如锈病、 轮纹病、赤斑病、褐斑病、黄化卷叶病（病毒）等，种类繁多，危害较大，主要为害叶片，有时也为害茎、叶柄和豆荚，如果病害大面积发生，可造成严重的经济损失[2]。目前植物病害防治以化学农药为主，不合理使用农药化肥、引起有害生物抗药性和农药残留等问题导致生态环境不断被破坏，农产品质量下降。所以正确鉴别病害，并针对相应病害因地制宜，采取合理的防治措施，以期达到作物生态环境的可持续发展[3]。

鉴别作物病害的常用方法有传统生物学方法、显微形貌观察、分子生物学方法，这些方法都需要丰富的经验、熟练的操作技能，且耗时长。傅里叶变换红外光谱（FTIR）是一种基于化合物中官能团和极性键振动的结构分析技术，能反映分子官能团的振动模式，具有指纹特性，已成为探测生物组织中大分子结构及相互作用的有力手段。红外光谱无需对样品进行分离提取处理，具有操作简便、快速、低成本、无污染的特点，已经大量用于植物、药物等方面的研究[4-8]。李志永等[9]用FTIR对蚕豆锈病、茎基腐病、轮纹病、黄化卷叶病叶片与健康叶之间的差异进行过分析，并用主成分分析和聚类分析对样品进行病害类型的分类取得了较好的效果。为此，以蚕豆轮纹病、蚕豆赤斑病、蚕豆黄化卷叶并和蚕豆锈病为研究对象，用傅里叶变换红外光谱结合曲线拟合对蚕豆不同病害叶进行鉴别研究。

1 材料与方法

1.1 材料

蚕豆叶样品于2011、2012年2～3月采自云南省曲靖市陆良县，样品自然干燥后保存待测。所有样品取样时避开叶脉，取病斑处的叶片。

用Perkin Elmer公司的Frontier傅里叶变换红外光谱仪测谱，光谱范围为4 000～400 cm-1，光谱分辨率为4 cm-1，扫描16次。

1.2 光谱采集及数据处理

取少量样品放入玛瑙研钵磨细，加入适量溴化钾（KBr）研磨均匀后压片，测红外光谱，样品光谱自动扣除溴化钾背景。每种样品采集5个红外吸收光谱，取这5个光谱的平均光谱作为该样品的红外吸收光谱。光谱经OMNIC 6.0红外光谱软件9点平滑、基线校正和归一化预处理；选取1 800～1 300 cm-1范围用软件Origin 8.5获取二阶导数谱，用软件Origin 8.5对原始光谱进行曲线拟合。

2 结果与分析

2.1 蚕豆叶片的红外光谱特征分析

蚕豆叶片的平均红外光谱如图1所示。从图1可以看出，蚕豆叶的FTIR谱主要峰有：3 410 cm-1附近有一强而宽的吸收峰，主要是O-H伸缩振动吸收[10]，2 920 cm-1和2 850 cm-1附近吸收峰归属于亚甲基（CH2）的反对称和对称伸缩振动[11]，2 954 cm-1附近吸收峰归属于甲基-（CH3）的反对称伸缩振动，主要来自蛋白质、碳水化合物、脂类等细胞壁组织成分；l 737 cm-1附近的吸收峰归属为脂类羰基振动吸收；1 650 cm-1附近的吸收峰归属于蛋白质酰胺I带C=O的伸缩振动吸收、1 548 cm-1附近的吸收峰归属于酰胺Ⅱ带N-H的弯曲振动和C-N的伸缩振动吸收；1 500～1 200 cm-1范围主要是蛋白质、脂肪、木质素和多糖的混合振动吸收区[12]，1 456 cm-1和1 380 cm-1附近的峰归属为甲基的不对称和对称变角振动吸收；1 265 cm-1附近的吸收峰归属于蛋白质酰胺Ⅲ带振动吸收[13]；1 152 cm-1附近的峰归属为多糖类的C-OH伸缩振动，1 075 cm-1附近的峰归属为多糖类的C-O伸缩振动。这些光谱特征反映了蚕豆叶的主要成分是蛋白质、多糖和脂类。

由图1可以看出，不同病害的蚕豆叶的红外变换光谱大致相似，在1 800～700 cm-1范围存在小的差异。二阶导数谱可以放大差异，提高光谱的分辨率。图2是不同病害叶的二阶导数谱，在1 800～1 300 cm-1波数范围内，比较不同病害叶的光谱可以看出，蚕豆锈病叶片（d）的两强峰位于1 575 cm-1和1 380 cm-1附近，蚕豆赤斑病叶片（b）的强峰位于1 575 cm-1附近，蚕豆健康叶片（e）的强峰位于1 470 cm-1附近，而其他两者在1 470 cm-1附近有一中强度吸收峰，另外，蚕豆锈病叶片（d）的两强峰1 575 cm-1比1 380 cm-1强。蚕豆健康叶片（e）在1 540 cm-1附近有一强峰，其他四者在1 530 cm-1处呈现很弱的峰。比较蚕豆轮纹病叶片（c）和蚕豆黄化病叶片（a）可知，在1 460 cm-1附近，蚕豆轮纹病叶片（c）的吸收峰强些，而在1 390 cm-1和1 440 cm-1附近蚕豆黄化病叶片（a）的吸收峰强些。由此可以看出，二阶导数谱可以将不同病害的豆叶区分开来。

2.2 曲线拟合

红外光谱吸收峰的强度往往由峰高、峰宽和峰强来决定，仅采用峰高来描述强度不够准确，经过傅里叶自去卷积和曲线拟合分峰处理后，使用峰面积来代表其强度更接近真实情况[14-16]。由图2可以看出，健康叶片和病害叶片的差异主要在1 700～1 500 cm-1波数范围。对1 700～1 500 cm-1波数范围的不同蚕豆病害叶的红外光谱进行曲线拟合，获得3个子峰，如图3所示。1 650 cm-1附近的吸收峰，主要是蛋白质酰胺I带吸收；1 550 cm-1附近的吸收峰，主要是蛋白质酰胺Ⅱ带吸收；1 605 cm-1附近是木质素的吸收峰。通过吸收峰面积比A酰胺I/A木质素、A酰胺Ⅱ/A木质素和A酰胺Ⅱ/A酰胺I可以判断叶片中蛋白质相对含量的变化。

通过傅里叶自去卷积和曲线拟合分峰处理后，黄化卷叶病得到3个子峰在1 559、1 610、1 654 cm-1，定义任意一个子峰面积除以3个子峰的面积和为该子峰的面积比例，黄化卷叶病相应子峰的峰面积比例分别为24.01%、36.55%、39.44%；赤斑病得到3个子峰在1 547、1 611、1 656 cm-1，相应子峰的峰面积比例分别为15.42%、42.98%、41.61%；轮纹病的3个子峰在1 565、1 611、1 654 cm-1，相应子峰的峰面积比例分别为32.39%、35.63%、31.98%；病叶3个子峰为1 546、1 606、1 654 cm-1，相应子峰的峰面积比例分别为13.94%、46.40%、39.65%；健康叶片3个子峰在1 563、1 605、1 654 cm-1，相应子峰的峰面积比例分别为38.86%、28.68%、32.47%。在1 605 cm-1处各图谱，谱峰、谱型以及吸收峰强度均相似。通过吸收峰面积比A酰胺I/A木质素、A酰胺Ⅱ/A木质素和A酰胺Ⅱ/A酰胺I可以判断不同病害叶中蛋白质相对含量的变化。

表1是不同蚕豆病害豆叶中蛋白质酰胺I带、酰胺Ⅱ带和木质素的峰面积比。由表1可以看出，健康豆叶中A酰胺I/A木质素大于1.1，其他都小于1.1，其中黄化病A酰胺I/A木质素接近1.1；黄化病、赤斑病、轮纹病和锈病中A酰胺Ⅱ/A木质素均小于1，而健康叶片的A酰胺Ⅱ/A木质素大于1.1；在A酰胺Ⅱ/A酰胺I中最大为1.20（健康叶片），最小为0.35（锈病）。结果表明，相对于健康叶片，不同病害感染的蚕豆叶中蛋白质的含量相对降低了。结果提示由子峰面积比差异有可能区分蚕豆不同病害叶。

3 小结

对4种蚕豆病害叶和健康叶样品进行了傅里叶变换红外光谱研究，结果表明蚕豆叶的主要成分是蛋白质、脂类和多糖。它们的红外光谱图在指纹特征区的峰形、峰强和峰位置整体相似。对1 700～1 500 cm-1范围光谱，经过傅里叶自去卷积和曲线拟合分峰处理后，3个子峰峰面积比（A1 650/A1 605、A1 563/A1 605和A1 563/A1 654）差异明显。研究表明，傅里叶变换红外光谱结合曲线拟合在鉴别不同蚕豆病害叶方面具有方便、快速、不破坏样品等优点。

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