klotho基因单核苷酸多态性与老年2型糖尿病的相关性研究

摘要：目的 研究老年人群Klotho基因3个单核苷酸多态性以及该多态性与老年2型糖尿病的相关性。方法 选择老年糖尿病患者315例、正常健康人群 383例作为研究对象。提取外周血白细胞基因组DNA，应用单一等位基因特异性引物PCR技术（SASP-PCR），检测Klotho基因3个SNP位点的基因型。结果老年糖尿病组的Klotho基因G-395A SNP AA等位基因频率较正常对照组显著增高（P=0.002），按性别进行分层研究，无论男性还是女性糖尿病病组，G-395A SNP AA等位基因型频率均较对照组增高，差异均具有显著性（P值分别为P=0.026，P=0.022）。糖尿病组的Klotho C370S CC等位基因频率较对照组增高，差异具有显著性（P=0.005），按照性别进行分层研究,男性糖尿病组的Klotho C370S CC等位基因频率较对照组明显增高，差异有显著性（P=0.000）。糖尿病组Klotho基因SNP F352V FF、FV及VV等位基因型频率较对照组均无显著性差异，按性别进行分层研究，无论男性还是女性糖尿病组，该等位基因型频率较对照组也均无显著性差异（P>0.05）。结论 本文研究发现Klotho基因 G-395A SNP与老年糖尿病有相关性，并发现AA等位基因型携带者人群易患糖尿病；同时发现Klotho C370S CC的男性携带者易患糖尿病；尚未发现Klotho基因F352V SNP与老年糖尿病有相关性。

关键词：Klotho基因；单核苷酸多态性；2型糖尿病；老年

Association of Single Nucleotide Polymorphism of Human Klotho Gene with Type 2 Senile Diabetes Patients

ZHOU Ting,LIU Xiao-lin,TIAN Xiao-chun,WU Ping,MA Hou-xun

(Department of Geriatrics,The First Affiliated Hospital of Chongqing Medical University,Chongqing 400016,China)

Abstract：ObjectiveTo investigate the three single nucleotide polymorphisms of Klotho gene in old people and the association between them and senile type 2 diabetes patients. Methods315 patients with senile diabetes and 383 healthy person are enrolled in the study ,extraction the DNA of peripheral blood leucocyte ,detect gene types of the three single nucleotide polymorphisms loci of Klotho gene with single allele specific primer PCR.Results1.allele AA frequency of the klotho gene G-395A SNP in patients with diabetes were significantly higher compared with healthy control(P=0.002)；stratified by gender, allele AA frequency of the klotho gene G-395A SNP were significantly higher in both males and females diabetes patients than healthy control(P=0.026 and 0.022).2. allele CC frequency of the klotho gene G-370S SNP in patients with diabetes were significantly higher compared with healthy control(P=0.005), stratified by gender, allele CC frequency of the klotho gene G-370S SNP were significantly higher in males diabetes patients than healthy control (P=0.000). 3.No significant difference was found between diabetes patient andhealthy control in the frequency of allele FF 、FV、 VV ofSNP F352V.No significant difference was found between diabetes patients and healthy people either when stratified by gender.Conclusion1. klotho gene G-395A SNP is related with senile diabetes, people with allele AA of G-395A are liable to diabetes . 2.Male patients with allele CC of G-370S are also liable to diabetes.3.klotho gene F352V is not related with senile diabetes.

Key words：Klotho gene;Single nucleotide polymorphism;Type 2 diabetes;Senile随着人口高龄化程度日益加剧，老年糖尿病患者人群明显增加，糖尿病已成为影响老年人群生命健康的重要疾病之一。目前研究证实，Klotho（克老素KL）基因是一种与衰老发生密切相关的基因[1]。 Bartke A等[2]研究发现，过表达KL基因的小鼠，寿命明显延长，其机制与Klotho诱导IGF-1合成及胰岛素抵抗有关，这就提示糖尿病的发生、发展可能与Klotho基因的生物学功能有关。为此，本文通过研究Klotho基因G-395A、F352V与C370S单核苷酸多态性（SNP），以及其与老年糖尿病相关性，以求为糖尿病早期干预研究提供线索。

1资料与方法

1.1一般资料研究对象来自于重庆医科大学附属第一医院老年病科（门诊及住院）在2007年2月~2009年5月收治的患者，其中符合1999年WHO糖尿病诊断标准的333例老年糖尿病个体作为研究组，其中男性206例，女性127例，平均年龄（72.70±7.94）岁，同时随机选择同期321名符合正常健康人群标准的健康个体作为老年对照组，其中男性196，女性125例，平均年龄（67.25±6.74）岁。详细采集记录包括年龄、性别、血压、身高、体重、血液生化指标在内的相关资料。所有研究对象均被告知本研究目的，并签署知情同意书。其中正常对照组入选标准为：①血压

1.2方法

1.2.1 DNA提取取外周静脉血2ml,EDTA抗凝，使用上海华舜生物工程有限公司提供的人类血液基因组DNA抽提试剂盒抽提外周血白细胞基因组DNA，操作方法按试剂盒说明进行。

1.2.2 KL G-395A、F352V与C370S基因多态性检测方法

1.2.2.1 KL G-395A、F352V与C370S基因多态性检测引物Klotho的基因序列及相应位点的SNP信息均参照NCBI,利用Primer5.0软件设计等位基因特异性引物，设计方法参见文献[4-6]，具体设计引物序列见表1。所有引物合成操作均由中国大连宝生物技术有限公司（TaKaRa）完成。

1.2.2.2 KL G-395A、F352V与C370S基因多态性检测方法Klotho G-395A SNP检测：PCR反应体系及反应条件，参照文献[4-6]进行。取PCR产物5ul，使用琼脂糖凝胶-溴化乙锭染色法电泳，凝胶成像系统观察结果并判断其结果。klotho基因G-395A多态性等位基因型为GG、GA、AA3种形式；其PCR扩增产物片段长度为147bps。

Klotho F352V SNP检测：PCR反应体系及反应条件，参照文献[4-6]进行。取PCR产物5ul，使用琼脂糖凝胶-溴化乙锭染色法电泳，凝胶成像系统观察结果并判断其结果。klotho基因F-352V多态性等位基因型为FF、FV、VV3种；其PCR扩增产物片段长度为230bps。

Klotho C-370S SNP检测： PCR反应体系及反应条件，参照文献[4-6]进行。取PCR产物5ul，使用琼脂糖凝胶-溴化乙锭染色法电泳，凝胶成像系统观察结果并判断其结果。klotho基因C370S多态性等位基因型为CC、CS、SS3种；其PCR扩增产物片段长度为285bps。

1.2.3生化指标检测 实验组和对照组均同时检测血清生化指标，包括总胆固醇（TC），甘油三酯(TG)，高密度脂蛋白(HDL-C)，低密度脂蛋白(LDL-C)，空腹血糖及餐后2h血糖等。所有生化指标检测均统一由重庆医科大学附属第一医院医学检验科实验室完成，以确保检验结果质量准确可靠。

1.3统计分析分析采用SPSS18.0软件，定性指标采用各组中所占的百分数表示，使用χ2检验进行分析。定量指标经正态检验后使用t检验，各项指标以P

2结果

2.1老年糖尿病组与对照组的基本情况老年糖尿病组与对照组基本资料对比结果显示：老年糖尿病组相对对照组来说，年龄、体重指数、高血压、血脂异常及冠心病均偏高，差异具有有显著性（P

2.2糖尿病组与对照组KL基因SNP各等位基因频率分布对Klotho基因G-395A SNP AA等位基因来说，在老年糖尿病组中，该基因频率较正常对照组明显增高，差异具有显著性（P=0.002）；按照性别进行分层研究，无论男性还是女性糖尿病亚组，Klotho基因G-395A SNP AA等位基因型频率均较对照组有显著性增高（P值分别为P=0.026；P=0.022）。另在老年糖尿病病组中，Klotho基因G-395A SNP GG等位基因频率较对照组明显降低，差异具有显著性（P=0.007）；若按性别进行分层研究，糖尿病组中仅女性亚组的GG等位基因频率较对照组减低，差异有显著性（P=0.003）。见表3。

老年糖尿病组Klotho C370S CC等位基因频率较对照组增高，差异有显著性（P=0.005）；按性别进行分层研究，糖尿病组中仅男性亚组Klotho C370S CC等位基因频率较对照组明显增高，差异有显著性（P=0.000）。老年糖尿病组Klotho基因SNP C370S CS等位基因频率较对照组减低，差异有显著性（P=0.005）；按性别分层研究，仅在男性糖尿病亚组Klotho基因SNP C370S CS等位基因频率较对照男性亚组明显减低，差异有显著性（P=0.000）。见表3。

老年糖尿病组Klotho基因SNP F352V FF、FV及VV等位基因型频率较对照组均无显著性差异；按性别进行分层研究，无论男性还是女性糖尿病亚组其等位基因型频率较对照亚组均无显著性差异（P>0.05）。见表3。

3讨论

老年人群中，糖尿病发病率明显增加，已成为影响老年人群健康的重要疾病，其中 2型糖尿病为老年糖尿病的主类型，其发病机制主要与胰岛素抵抗或胰岛素敏感性降低等因素有关。近年来研究发现，Klotho基因及其表达产物-klotho蛋白在胰岛素、IGF-1信号通路中起到十分重要的调节作用，由此推测Klotho基因与糖尿病的发病可能有着密切的内在相关性。动物实验研究表明KL基因缺失的小鼠血糖和胰岛素的水平降低，而其胰岛素的敏感性增加[3,7]。新近研究[8，9]也发现klotho 在钙平衡、糖代谢中发挥作用。而有关Klotho基因SNP与糖尿病之间的相关性研究报导甚少，为此，通过研究Klotho基因SNP单基因型及其基因型组合分布规律，以期阐述其与老年人群2型糖尿病的相关性，为老年人群糖尿病早期干预提供依据。

本文研究发现，老年糖尿病组中，Klotho基因G-395A SNP AA等位基因频率较正常对照组高，其差异具有显著性；按性别进行分层研究，无论男性还是女性糖尿病亚组人群，Klotho基因G-395A SNP AA等位基因频率均较正常对照亚组显著性高，即提示携带有G-395A SNP AA等位基因型的老年人群，其罹患糖尿病的风险高。另外，糖尿病病组Klotho基因G-395A SNP GG等位基因频率较对照组降低，而在女性糖尿病亚组患者中其GG等位基因型频率较对照组亦降低，则提示对于老年女性人群，G-395A GG等位基因携带者罹患糖尿病的风险可能会下降。

糖尿病组Klotho C370SCC等位基因频率较对照组高，同时，在男性糖尿病患者中 ，Klotho C370S CC等位基因频率亦较对照组增高，这就提示携带CC等位基因的人群，尤其是男性人群发生糖尿病的几率增高。另外，本文研究结果显示糖尿病组Klotho基因SNP C370S CS等位基因频率较对照降低，并发现在男性糖尿病亚组患者中Klotho C370S CS等位基因频率较对照亦明显减低，提示携带有CS等位基因的老年人群，尤其是男性人群不易患糖尿病。

本文研究还发现，糖尿病组Klotho基因SNP F352V FF、FV及VV等位基因型频率较对照组均无显著性差异，按性别进行分层研究，各性别亚组在糖尿病组及正常对照组之间均无统计学差异（P>0.05），提示Klotho 基因SNP F352V与糖尿病的发生可能无明显相关性。国外学者Freathy等[10]研究也发现在英国高加索人群中，KL-VS功能性突变与其糖尿病也无明确相关性。

综上所述，本文研究发现G-395A AA等位基因型携带者易患糖尿病，提示Klotho基因 G-395A SNP与老年糖尿病有相关性；同时发现在Klotho基因SNP中 CC等位基因的男性携带者易患糖尿病，即提示Klotho基因SNP与糖尿病发病易感性有关，这就为人们开展针对糖尿病的易感性基因型筛检研究提供新线索。但基于本组资料样本偏小，其研究结论尚需进一步研究证实。

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