牙周炎微生物量和疗效的联系

本文作者：周婷 丁一 徐屹 谢萍 单位：贵州省人民医院口腔科 四川大学华西口腔医学院

洁刮治(scalingandrootplaning，SRP)是牙周炎基础治疗的主要方法，对于龈下菌群的组成和数量有着明显的影响［1］，洁刮治后龈下菌群中某些细菌的持续存在会对治疗效果及预后产生一定的影响。治疗后龈下微生物的变化是影响慢性牙周炎洁刮治效果的重要因素之一［2－5］。研究通过对慢性牙周炎患者SRP治疗前后临床指标变化的观察，并同时半定量检测5种龈下微生物:牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonasgingival-is，P．g)、福赛氏类杆菌(Tannerellaforsythia，T．f)中间普氏菌(Prevotellaintermedia，P．i)、伴放线放线杆菌(Aggregatibacteractinomycetemcomitans，A．a)和齿垢密螺旋体(Treponemadenticola，T．d)，分析这5种微生物检出量的变化与SRP疗效的关系，初步探讨对预测和评估SRP疗效有价值的微生物指标。

1材料和方法

1．1材料本研究纳入四川大学华西口腔医院牙周科门诊就诊患者中诊断为慢性牙周炎(见Dr．Armitage1999年新分类)的患者20名，男性8例，女性12例，年龄28～53岁。每个患者至少有20颗天然牙，至少有2个牙的牙周袋深度≥4mm;且无任何影响牙周炎进程或治疗的全身性疾病，3个月内未接受过牙周治疗或1个月内未服用过抗生素者。对纳入的患者全口牙周状况进行全面检查后，选择2个牙周袋探诊深度≥4mm的位点作为检测位点，所选位点不在同一象限。对纳入的40个研究位点采取龈下菌斑样本和临床指标检查［包括牙周探诊深度(probingpocketdepth，PPD)，临床附着丧失量(clini-calattachmentloss，CAL)探诊出血(bleedingonpro-bing，BOP)］，然后行龈上洁治术，并给予口腔卫生指导。一周后复查，行龈下刮治和根面平整。3个月后进行复查，再次取龈下菌斑样本和记录临床指标。所有检查和治疗由同一人进行，有3人失访。

1．2微生物样本采集选好位点后，用手工刮治器先去除龈上菌斑及牙石，棉卷隔湿，先后用2根40号无菌纸尖分别插入牙周袋底，各停留20s取出，放入无菌的1．5mlEppen-dorf管中，－20℃保存，备用。

1．3DNA的提取采用高纯度PCR模板制备试剂盒(HighPurePCRTemplatePreparationKit，RocheDiagnostics，Mannheim，Germany)提取DNA。－20℃保存，备用。

1．4multi-PCR和反杂交dNTP和生物素标记的引物由microDentkit(HainDiagnostikGmbH，Germany)提供。反应体系:5μlPCRbuffer，5μl25mmol/LMgCl2，1μlTaq酶，35μl引物和dNTP的混合物，5μl的样本DNA，阴性对照则加入5μl无菌双蒸水。PCR反应条件:预变性95℃5min;变性95℃30s，58℃2min，10个循环;变性95℃25s，退火53℃40s，延伸70℃40s，20个循环;延伸70℃8min。将PCR反应产物用microDentkit进行反杂交，将已有生物素标记的PCR扩增产物变性解链，加入杂交液，45℃条件下与已固定有2个阳性对照带和5个牙周致病微生物特异DNA探针的硝酸纤维膜孵育30min。当样本中的牙周致病微生物PCR扩增产物和与之互补的特异DNA探针结合后，洗涤去除与探针非特异结合的DNA。加入细菌蛋白－碱性磷酸酶复合物及其底物，使特异结合在硝酸纤维膜上的，生物素标记的牙周致病菌PCR扩增产物显紫蓝色。微生物检测结果如图1所示，根据杂交带上不同位置区分细菌种类，CC为杂交反应阳性对照带，AC为PCR扩增反应阳性对照带，在每个样本的结果中都必须出现这2条带，表示扩增和杂交反应都是正常进行的。染色带的深浅代表细菌量的差异，由同一观察者按+++(与对照带一致)，++(介于+++与+之间)，+(弱显色)，－(未见显色)4个等级区分。图1中的检测结果为A．a(+++)，P．i(++)，P．g、T．f、T．d均为(+)。

1．5统计方法使用SPSS13．0统计软件对结果进行统计分析。以位点为统计对象，将PPD和CAL值各自求平均值，采用成组设计的T检验进行比较，BOP阳性位点率的比较采用2×2的四格表卡方检验或确切概率法。检验水准α=0．05。微生物检出量按+++，++，+，－分为4个等级，采用非参数检验的Mann-WhitneyU检验进行比较。检验水准α=0．05。

2结果

2．1SRP治疗后临床指标的变化结果如表1所示，在治疗前平均PPD为6．46mm，平均CAL为6．95mm，BOP阳性率为100%。在通过牙周基础治疗后，PPD及BOP的改善具有统计学意义(P值均为0．000)，而CAL的改善不具有统计学意义(P=0．089)。

2．2SRP治疗后微生物检出量的变化根据治疗后PPD的变化，分为PPD减少≥2mm组和PPD减少＜2mm组，分别有21个位点和19个位点。分别观察2组治疗前后微生物的检出量的变化。从图2～3可以看出，在PPD减少≥2mm组P．g、T．f和T．d的检出量在治疗后明显减少，其差异具有统计学意义(P值分别为0．001、0．000和0．029)，但P．i的检出量却出现了显著增加(P=0．001)。而在PPD减少＜2mm组这5种微生物治疗前后的变化无统计学意义。分别对治疗前和治疗后在PPD减少≥2mm组与减少＜2mm组的微生物检出量进行比较发现，在治疗前，减少≥2mm组P．g和T．d的检出量显著高于减少＜2mm组(P值分别为0．041和0．037)，T．f也有同样的差别，但差别无统计学意义。在治疗后，T．f的检出量在减少＜2mm组明显高于减少≥2mm组(P=0．010)。

2．3微生物检出量的变化与临床指标之间的关系按治疗前后微生物的变化分成2组:A组为治疗后该微生物水平减少一个(+)及以上;B组为治疗后该微生物水平增加或不变。分别观察2组间PPD、CAL和BOP的改善有无差异性。结果如表2所示，P．g和T．fA组的PPD改善显著大于B组，而T．f和T．dA组的BOP阳性率也小于其B组的BOP阳性率，差异具有统计学意义。在本研究中，A．a和P．i在治疗前后的变化与临床指标改善程度之间的关系无统计学意义。

3讨论

大量资料表明，牙周炎患者龈下微生物的组成具有多样性和复杂性，有研究显示龈下菌群中有70%是属于不可培养和难培养菌［5］，但随着PCR技术的发展，对龈下微生物的定性及定量检测越来越准确。有研究表明龈下微生物的变化要早于临床指标的变化［6］，所以研究者们希望通过对基线时或治疗后微生物水平的检测，能够对牙周患者预后和治疗效果作出更准确及时的判断。本实验采用microDentkit的所需实验条件及设备简单，能同时对5种牙周主要致病微生物进行半定量检测，与传统PCR相比，不需要微生物标准株作为阳性对照，杂交纤维膜上有2个阳性对照，分别表示PCR扩增反应及杂交反应的正常进行。该试剂盒能够为牙周致病微生物的临床快速检测提供高效、准确的检测结果。临床指标的改善总是伴随着龈下细菌组成及量的改变［7］。在本研究中，PPD减少≥2mm组和PPD减少＜2mm组间微生物在治疗前后的变化也不相同，在PPD减少≥2mm组P．g、T．f和T．d的量都有明显减少，而PPD减少＜2mm组的这5种微生物都无显著的变化。提示PPD的改善与P．g、T．f和T．d量的减少有关，这与Haffaijee等［8］的研究结果相似。但治疗后在PPD减少≥2mm组P．i的检出量反而出现了增加，提示在这一研究人群中P．i并不作为牙周优势致病菌存在，相比P．g、T．f和T．d对治疗效果的影响而言，P．i量的增加并未对治疗效果产生明显影响。而Doungwdomdacha［9］和Kook等［10］均报道治疗后P．i的检出量或率降低，该结果有待扩大样本进一步探讨。本研究发现治疗前P．g和T．d的检出量在PPD减少≥2mm组反而高于PPD减少＜2mm组(P＜0．05)，可见虽然基线时有高水平的P．g和T．d，只要通过治疗后能显著减少P．g和T．d的量，同样会获得好的治疗效果，在经过SRP治疗后，T．f的检出量在PPD减少≥2mm组显著低于PPD减少＜2mm组，提示在治疗后如果存在高水平的T．f将会影响治疗的效果，这与Fujise等［11］的研究结果相似。本实验显示，治疗后P．g、T．f和T．d检出量减少的位点(A组)PPD和BOP的改善都大于治疗后该微生物未减少的位点(B组)。Mineoka等［12］的研究也发现P．g、T．d、T．f的数量与PPD的深度和BOP阳性率有相关性。其中P．g和T．fA组PPD的改善显著大于其B组，T．f和T．dA组的BOP的改善显著大于其B组，差异具有统计学意义，提示P．g和T．f的检出量的减少与PPD的改善关系较为密切，而T．f和T．d与BOP的关系较为密切。本研究结果提示P．g、T．f和T．d量的增加或持续存在会对慢性牙周炎SRP治疗后PPD和BOP的改善有较显著的影响。有效控制这三种细菌对于PPD和BOP获得更大程度的改善是很重要的。在经过SRP治疗后，CAL有轻微的改善，但与治疗前相比，无明显差异，可见只通过SRP在3个月较短的观察期内是很难获得明显的牙周附着改善的，且CAL的改善在5种微生物A组和B组间都没有显著差异。在本研究中，没有发现A．a和P．i的变化与临床指标改善间有相关性。综上所述，本研究结果提示在所检测的5种龈下可疑致病微生物中，P．g、T．f、T．d减少与SRP治疗后牙周组织炎症减轻密切相关。有效控制龈下菌群中的P．g、T．f和T．d能获得更多PPD和BOP的改善。提示P．g，T．f和T．d可以作为评估治疗效果的标志性微生物。由于牙周微生物分布、组成复杂，不同人群牙周致病菌的分布情况不同，因此要确定不同人群中可以预测或评估牙周炎治疗效果的标志性微生物还需要进一步扩大样本深入研究。