δ阿片受体激动剂对LPS诱导的巨噬细胞凋亡及坏死的影响

[摘要] 目的 研究δ阿片受体激动剂DADLE对LPS诱导的巨噬细胞凋亡和坏死的影响。 方法 用LPS（100 μg/L）刺激大鼠腹腔巨噬细胞，在LPS后立即或4 h后加入DADLE（10-6 M）。流式细胞仪和共聚焦成像检测巨噬细胞凋亡及坏死，ELISA法检测巨噬细胞细胞核NF-κB的活化水平，Western blot法检测p38 MAPK活化水平，ELISA法检测细胞培养上清TNF-α、IL-1β和HMGB1水平。 结果 DADLE明显抑制了LPS诱导的巨噬细胞凋亡及坏死，降低了细胞培养上清中TNF-α、IL-1β和HMGB1的水平，而且对巨噬细胞NF-κB及p38 MAPK的活化均有抑制作用。 结论 DADLE通过抑制NF-κB及p38 MAPK的活化，减少了LPS诱导的巨噬细胞凋亡、坏死及细胞因子的释放。

[关键词] DADLE；LPS；高迁移率族蛋白1；巨噬细胞；凋亡

[中图分类号] R392 [文献标识码] A [文章编号] 1673-9701（2013）07-0009-03

Effect of delta-opioid receptor agonist on LPS induced apoptosis and necrosis of macrophages

DU Huimin1 XU Jue1 HUANG Sanxiong2 LUO Xudong1 LAN Longjiang1 Li Manqun1 BAO Ying2

1.Department of Otolarynology-Head and Neck Surgery，the First People’s Hospital Affiliated to Huzhou University Medical College，Huzhou 313000， China；2.Department of Hepatobiliary Surgery，First People’s Hospital Affiliated to Huzhou University Medical College，Huzhou 313000， China

[Abstract] Objective To study the effect of delta-opioid receptor agonist （DADLE） on LPS induced apoptosis and necrosis of macrophages. Methods Peritoneal macrophages isolated from rats were challenged with LPS. DADLE at 10-6 M was administrated concurrently or 4h after LPS. Apoptosis and necrosis of macrophages were determined by flow cytometry analysis and confocal imaging. NF-κB activity in macrophages was determined by ELISA. Levels of activated p38 MAPK were measured by western blot. Levels of TNF-α，IL-1β and HMGB1 in culture supernatant were determined by ELISA. Results TNF-α，IL-1β and HMGB1 in supernatant were also suppressed by DADLE.LPS-induced apoptosis and necrosis of macrophages were significantly suppressed by DADLE. DADLE also inhibited the p38 MAPK and NF-κB pathways. Conclusion DADLE attenuates LPS induced apoptosis and necrosis of macrophages and cytokine release by suppressing the p38 MAPK and NF-κB pathways.

[Key words] DADLE； LPS； High-mobility group box 1 protein； Macrophage； Apoptosis

脂多糖（LPS）是革兰阴性细菌的内毒素，由菌体特异侧链、核心多糖和类脂A组成，LPS可以与Toll样受体结合，刺激单核巨噬细胞激活、凋亡，并释放肿瘤坏死因子（TNF）-α， 白介素（IL）-1β 和高迁移率族蛋白1（HMGB1）等细胞因子，正是这些炎症因子介导了脓毒症的损伤作用[1，2]。δ阿片受体广泛表达于免疫细胞，并对免疫细胞的增殖、凋亡及信号转导具有调节作用[3-5]。δ阿片受体激动剂DADLE（D-Ala2-D-Leu5-enkephalin）是一种人工合成的非选择性δ阿片受体激动剂，有人发现用DADLE预处理巨噬细胞后，可以下调LPS诱导的巨噬细胞p38 MAPK活化，减少TNF-α等一系列炎症因子的释放[4]，具有明显的免疫调理功能。我们以往的研究发现DADLE能明显降低脓毒症大鼠的死亡率[6]，而其机制尚不完全明确，因此本研究通过体外实验研究δ阿片受体激动剂DADLE对LPS诱导的巨噬细胞凋亡的影响，为DADLE对脓毒症大鼠的保护作用寻找新的理论依据。

1 材料与方法

1.1材料

LPS（大肠杆菌血清型为O111：B4）和DADLE购自Sigma公司（中国上海）。TNF-α和IL-1β ELISA检测试剂盒购自R&D公司（美国），HMGB1 ELISA检测试剂盒购自Shino-Test公司（日本）。

1.2 细胞培养

雄性SD大鼠（10～12周龄）腹腔注射不含小牛血清的RPMI 1640培养液10 mL，轻揉大鼠腹部2～3 min，静置50 min后将大鼠颈椎脱臼处死，置于解剖板上，用针头固定四肢，无菌条件下打开腹腔，用注射器抽取腹腔液，离心5 min，弃上清，应用PBS洗涤2遍，再用含10%热灭活胎牛血清的RPMI 1640培养液调节细胞浓度至1×106细胞/mL，接种于培养瓶及6孔培养板。置37℃、含5%CO2的培养箱培养2 h，弃上清液，用不含小牛血清的RPMI 1640培养液漂洗2遍然后用RPMI 1640培养基（含10%热灭活胎牛血清、2 mM谷氨酰胺以及抗生素：青霉素100 U/mL，链霉素100 μg/mL），在37℃、含5%CO2的恒温箱内培养，并作台盼蓝染色、瑞氏染色。分离得到的腹腔巨噬细胞用LPS（100 μg/L）刺激，在LPS后立即或者LPS后4 h加入DADLE（10-6 M），每组设置8个复孔，并重复3次。

1.3 TNF-α、IL-1β和HMGB1的检测

培养上清的TNF-α或IL-1β水平检测使用ELISA试剂盒，并以纯化重组TNF-α或IL-1β在不同稀释度的标准曲线计算测定血TNF-α或IL-1β水平。培养上清的HMGB1水平检测使用ELISA试剂盒，应用纯化重组的HMGB1在不同稀释浓度的标准曲线计算确定。

1.4 巨噬细胞核因子（NF）-κB活性测定

分离正常大鼠腹腔巨噬细胞用LPS（100 μg/L）刺激，在LPS后立即或者LPS后4 h加入DADLE（10-6 M）。LPS刺激18 h后收集细胞。用核提取试剂盒（购自Active Motif 公司）进行巨噬细胞的细胞质和核提取，按照说明书操作，基于106个细胞样本，避免反复冻结/解冻。首先，收集细胞，置于含有磷酸酶抑制剂的预冷的PBS中。然后，将细胞悬浮于低渗缓冲液，使细胞膜变得肿胀和脆弱。添加洗涤剂，造成细胞质的蛋白质泄漏到缓冲液中。在预冷至4℃离心机14 000×g离心30 s后，收集上清以备细胞浆提取物（用以后续检测p38 MAPK活性）。沉淀物就是细胞核，用来提取细胞核提取物。溶解细胞核，将白质裂解液溶解在含有蛋白酶抑制剂缓冲液中。核提取物制备完成后，即可检测细胞核的NF-κB（NF-κB p65亚基）的水平，同样，也是运用ELISA试剂盒（Trans AMTmNF-κB p65 Kit 购自Active Motif）。

1.5 巨噬细胞p38丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）的活性检测

巨噬细胞p38丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）的活性检测通过Western blot法检测磷酸化p38 MAPK水平。使用TCA法检测所获得的巨噬细胞的细胞浆提取物总蛋白浓度，使用BSA作标准曲线（Pierce，IL，美国）。取等量的细胞质蛋白（100 μg）在10%的SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳，并转移到PVDF膜。将膜在室温下放置1 h，然后放入含有5%脱脂奶粉的TBS（300 mM氯化钠，pH值7.6的40 mM Tris）中1 h，封闭非特异性结合位点。分别与1∶1 000稀释的抗-p38 MAPK多克隆抗体或抗磷酸化p38 MAPK的兔单克隆抗体的在含有0.1%吐温20（TBST）的TBS（购自Cell Signaling Technology公司，上海）中4℃孵育过夜。将膜用TBST洗涤3次，然后与1∶2 000稀释的辣根过氧化物酶标记的抗兔IgG（购自Cell Signaling Technology公司）孵育1 h。化学发光试剂增强反应，X线片压片曝光。

1.6 流式细胞仪和共聚焦成像检查

分离正常大鼠腹腔巨噬细胞用LPS（100 μg/L）刺激，在LPS后立即或者LPS后4 h加入DADLE（10-6 M）。 LPS刺激18 h后收集细胞。收获的巨噬细胞悬浮在浓度为1×106个细胞/mL，用凋亡检测试剂盒Annexin V-FITC（购自R&D公司）测量细胞凋亡。使用FACScan（Becton Dickinson公司，加利福尼亚州圣何塞）和CellQuest软件（Becton Dickinson公司）分析细胞死亡率。共聚焦激光扫描显微镜（蔡司LSM510，德国卡尔蔡司）下观察细胞形态，并拍摄图像。

1.7 统计学分析

采用SPSS17.0软件处理数据。计量资料应用均数±标准差（x±s）表示，多组间比较用方差分析，组间两两比较采用q检验。P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 DADLE抑制LPS诱导的巨噬细胞炎症因子的释放

在脓毒症时炎症因子释放的调控是极其复杂的，除了内毒素以外，如TNF-α和IFN-γ等炎症因子本身也可以刺激巨噬细胞/单核细胞释放更多的炎症因子，产生瀑布效应[7，8]。我们发现DADLE对LPS刺激后巨噬细胞炎症因子的释放有明显的抑制作用（表1）。

表1 DADLE对LPS刺激后巨噬细胞炎症因子释放的抑制作用

（x±s，ng/mL，n = 8）

注：与对照组比较，P < 0.05，*与LPS+生理盐水组比较，P < 0.05，#与LPS+DADLE组比较，P > 0.05

2.2 DADLE抑制LPS诱导的巨噬细胞的细胞死亡

我们发现LPS对巨噬细胞有明显的诱导凋亡和坏死的作用，DADLE（10-6 M）不论在LPS后立即或者4 h后给药均能抑制LPS诱导的巨噬细胞凋亡和坏死（图1）。

2.3 DADLE对LPS刺激后巨噬细胞的信号转导的调控

LPS刺激后增加了NF-κΒ和p38 MAPK的激活，DADLE（10-6 M）不论在LPS后立即或者4 h后给药均能抑制LPS诱导的巨噬细胞p38 MAPK和NF-κB信号转导通路的激活（图2）。

3 讨论

在本研究中，我们发现DADLE明显抑制了LPS诱导的TNF-α和IL-1β及HMGB1的产生，虽然早期炎症因子TNF-α和IL-1β可能并不是脓毒症的关键介质[9]。而HM-GB1作为晚期炎性因子，是脓毒症致死效应的重要炎性介质。给予HMGB1可模拟严重脓毒症的病理生理，引起发热、肠屏障功能的紊乱、急性肺损伤和多器官功能衰竭[9-11]。运用HMGB1的特异性拮抗剂中和血清HMGB1能改善内毒素血症和脓毒症[12，13]。因HMGB1有较宽的治疗时间窗，已被确定作为治疗的靶点。我们的研究结果表明，DADLE对LPS诱导的抑HMGB1的释放，可能是脓毒症治疗过程中减轻炎症反应的关键所在。

巨噬细胞活化是脓毒症的炎症损伤的一个关键组成部分，活化过程中产生活性氧（ROS）和各种炎性细胞因子[14]。p38 MAPK和NF-κΒ途径对巨噬细胞活化和细胞因子的释放[15-18]起到关键作用。我们的研究发现δ阿片受体激动剂调节巨噬细胞活化，并通过调节LPS诱导的p38 MAPK和NF-κB的活化来抑制炎症因子的释放。脓毒症过程中巨噬细胞的凋亡和坏死同样扮演了重要作用，以前的研究表明，只有坏死的细胞才可以释放HMGB1到细胞外环境，引起炎症反应，而细胞凋亡则不会[19]。但有研究表明，当细胞凋亡转变到晚期凋亡[20，21]时可释放HMGB1并引起炎症反应。因此，细胞死亡，无论是凋亡或坏死，均能引发脓毒症的炎症级联反应，最终导致休克。我们的研究结果显示，DADLE能够减少LPS诱导的巨噬细胞的死亡，下调HMGB1的释放。

因此可以推测，DADLE对脓毒症大鼠的保护作用的机制可能是降低p38 MAPK和NF-κΒ的活性，抑制巨噬细胞的活化和凋亡，从而减少HMGB1的释放。

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（收稿日期：2012-12-28）