肿瘤细胞多药耐药基因及产物p糖蛋白检测方法的研究进展

摘要: 肿瘤细胞对化疗药物的多药耐药（MDR）是目前肿瘤病人化疗失败的主要原因。肿瘤细胞的多药耐药有多种类型。本文对Mdr1基因及P糖蛋白（pgp）的生物学特性及检测方法作一综述。

目前，化疗仍然是治疗恶性肿瘤的重要手段，尽管化疗方案的改进及新药的使用，临床化疗效果越来越好，但仍然发现一些患者在化疗前后对某些药物产生耐药性，从而影响化疗效果。研究发现，导致肿瘤化疗失败的原因之一是肿瘤对化疗药物的多药耐药。多药耐药是指由一种药物诱发，对该药耐药的同时，对其结构和作用机制无关的化疗药物产生交叉耐药。多药耐药的类型有多种。如Mdr1及其产物pgp的表达增高，多药耐药相关蛋白基因的扩增或表达增加，DNA拓朴异构酶Ⅱ活性增高或性质发生改变，谷胱甘肽解毒系统酶活性增高等。本文就Mdr1和pgp的生物学特性及检测方法作一综述。

1 多药耐药基因1（Mdr1）和P糖蛋白（pgp）的生物学特性

1.1 Mdr1 MDR基因在人类有二种Mdr1和Mdr2，其中Mdr1与肿瘤的多药耐药有关。Mdr2的功能尚不清楚，但Mdr1和Mdr2基因序列具有较高的同源性。人类Mdr1基因位于第7号染色体长臂上，含有28个外显子，内含子与外显子交界符合经典的A/G规则，全长为4.5Kb，含有一个开放读框，编码1280个氨基酸多肽，经糖基化后形成170KD的pgp[1]。目前对Mdr1基因的表达调控还处于研究之中。研究表明抗肿瘤药物、致癌剂、紫外线、热应激等都可使Mdr1基因活化，ras、raf、p53等癌基因也参与Mdr1基因的表达调控[2，3]。有人发现，在原发性乳腺癌患者中，Mdr1基因的转录受Y盒转录因子（YB-1）的调节，而且YB-1的位置与Mdr1基因表达密切相关，在对药物敏感的乳腺癌细胞株MCF-7中，YB-1位于胞浆中，而在耐药细胞株MCF-7中，YB-1位于细胞核中，因此认为YB-1也参与Mdr1基因的调控[4]。

1.2 pgp pgp是由Mdr1基因编码、其分子量为170KD、由1280个氨基酸组成的跨膜糖蛋白，由两个同源部分组成，两部分之间的同源性大约为48%，每一部分约含有6个疏水跨膜区和一个ATP结合位点，通过ATP供给能量，将亲脂性药物泵出细胞外。在正常人体的肾上腺、肾、肝、结肠、胰及脑毛细血管内皮细胞中均有Mdr1 pgp的表达，其生理功能为将细胞内的毒性代谢产物泵出细胞，对组织细胞起保护作用。在脑组织中，Mdr1 pgp对维持血脑屏障起重要作用，它可将内皮细胞中的异物（物药、致癌物等）排列毛细血管腔而保护脑组织。在正常人体的造血干细胞，T、B淋巴细胞，NK细胞上都有pgp表达，其生理功能仍不清楚，但研究表明pgp参与人体外周血T淋巴细胞中的细胞因子（如IL-2，IL-4，α-IFN）的输送[5，6]。Mdr1被克隆并发现在某些正常组织中表达后，人们就开始对肿瘤组织中的Mdr1进行分析。在肿瘤细胞中，pgp通过ATP供能，将长春新碱、秋水仙素、放线菌素D等药物泵出细胞外，导致肿瘤细胞耐药。

2 Mdr1和pgp的检测方法

Mdr1和pgp的检测方法主要有两类，一类是蛋白质定法，包括免疫组化法、免疫印迹法和流式细胞仪检测法等。一类是mRNA测定法，包括Northen blot、Slot blot、RNA原位杂交法及RT-PCR检测法。

2.1 免疫组化法 常用的方法是免疫组化ABC法。冰冻切片常规处理后，与抗pgp的单克隆抗体孵育，然后加入生物素标记的二抗孵育，再加亲合素-过氧化酶复合物孵育、洗片，最后用含0.03%-0.05%过氧化氢的DAB液显色分析结果。免疫组化法是较传统的检测方法，由于其操作简便，不需要贵重仪器，且可分析肿瘤细胞的异质性，因此是目前国内外常用的检测方法。由于其特异性和敏感性较低，且需要冰冻组织切片，因此1994年karoly等对此方法进行了改进，创建了一种新的“免疫组织化学夹心染色法（LPS）”，此方法直接用福尔马林固定的组织细胞，经石腊包理、切片、过氧化氢处理后，与抗pgp的单克隆抗体JSB-1孵育后有序地加三层过氧化物酶标记的第二抗体[第一层为过氧化物酶标记的兔抗鼠IgG f(ab’)2，第二层为鼠单克隆过氧化酶 抗过氧化酶复合物，第三层为过氧化物酶标记的兔抗鼠IgG f(ab’)2]的孵育、洗片、染色、分析结果。

LPS法直接取组织细胞固定，不需使用冰冻切片，且因增加了三层过氧化物酶标记的第二抗体，使免疫染色密度增加，结果更清晰。由于JSB-1抗体对Mdr1 pgp具有特异性，与Mdr2 pgp无交叉反应，因此提高了LPS法的特异性。以往免疫组化结果不能进行定量分析，此方法在应用上受到一定的限制，近年来由于数学显微图像分析方法的应用，免疫组化结果可进行定量分析，使得免疫组化法更具实用性[7，8]。

2.2 免疫印迹分析法 粗膜蛋白经电泳分离后转移到硝酸纤维薄膜上，用抗pgp单克隆抗体作为一抗，同位素标记的兔抗鼠IgG为二抗进行免疫印迹反应，分光光度计进行定量分析。此方法利用抗原抗体的特异反应，排除了其它蛋白质的干扰，但敏感性较低[11]。

2.3 流式细胞仪（FCM）分析法 取单个核细胞分装小管，加入荧光标记的抗pgp单克隆抗体进行孵育，用荧光标记的小鼠IgG作阴性对照，PBS冲洗除去未给合的荧光抗体后，FCM定量分析，以20%以上细胞染上荧光者判定为pgp阳性。FCM检测pgp，取材方便，可直接取肿瘤组织细胞，骨髓，还可取外周静脉血，操作简便、快速（每秒可测5000-10000个所要细胞）、准确，能对pgp进行定量分析，适宜批量标本检测，但由于仪器价格昂贵，目前只有少数实验室可进行FCM分析法[10]。

2.4 Northern Blot和Slot Blot检测法 用异硫氰酸胍溶液抽提细胞质中RNA，氯化铯溶液进行梯度离心，抽提的RNA经过变性、分光光度计下测定其浓度，电泳后转移到硝酸纤维薄膜上（Slot blot分析法则直接将RNA点在硝酸纤维薄膜上），用50%甲醛、5×Denhardt’s、5×SSC溶液和DNA模板与放射性标记的Mdrl cDNA探针进行预杂交和杂交、放射自显影后分光光度计进行定量分析。通过这两种方法检测Mdr1 mRNA较敏感，但不足之处是需要的标本量较大，且需用放射性标记的探针，会引起同位素污染。

2.5 RNA原位杂交法 石腊包埋切片按常规处理后与放射性标记的Mdrl cDNA探针进行杂交，放射自显影后进行结果分析。此方法采用完整细胞作为测定对象，能分析Mdr1过度表达的个别细胞或细胞亚群，但系手工操作，较难掌握[10]。

2.6 RT-PCR检测法 提取样本总RNA，合成cDNA，以cDNA为模板进行PCR扩增。PCR反应总体积一般为25μL，含0.1μg的模板DNA，20μmol/L,4dNTPS,Taq dNA聚合酶10×buffer 5uL,Mdr1基因上下游引物及内对照β1微球蛋白（β2M）上下游引物各20pmol。PCR扩增产物经琼脂糖电泳后，紫外灯下照像，激光密度扫描仪定量分析。以β2M为定量内参标，以Mdr1/β2M的比值大小来代表Mdr1水平的高低。

RT-PCR产物的绝对定量很困难，因RNA的提取、纯度测定、cDNA逆转率和PCR扩增效率各个环节均影响Mdr1 mRNA定量分析的精确度，因此在检测过程中需要设内对照，一般选择与Mdr1基因扩增动力学相似的β2M作为内参标，以Mdr1/β2M比值大小来衡量Mdr1水平的高低，从而消除上述因素引起的定量误差。由于Mdr1基因的多态性，在设计RT-PCR引物时要避开Mdr1和Mdr2基因结构的同源区，使引物具有较高的特异性，同时要使引物位于不同的外显子上，避免可能污染的基因组DNA扩增。RT-PCR检测法标本用量小、特异性强、敏感性高，同时可以避免同位素污染。

肿瘤细胞对化疗药物产生耐药是造成肿瘤化疗失败的主要原因，而Mdr1/pgp的高表达又是MDR的主要机制。许多研究表明Mdr1/pgp与病人治疗结果密切相关，Mdr1阳性病人生存期短，缓解率低，复发率高，因此，Mdr1/pgp的分析可作为癌症治疗结果的预测指标，也是临床医生制定治疗方案的参考依据。因此，Mdr1/pgp的检测有其重要性。Mdr1/pgp检测方法有多种，各具其优缺点 ，对于高表达的Mdr1/pgp各种检测方法所得的结果基本一致，对于低表达的Mdr1，采用RT-PCR检测所得的结果较可信。由于RT-PCR检测方法标本用量少，敏感性高，在引物设计时，若避免与Mdr2基因结构的同源区，具有较高的物异性，同时又无同位素污染。因此，RT-PCR检测法是目前检测多药耐药的一种较理想的检测方法。

参考文献

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