荧光定量聚合酶链式反应联合检测性病病原微生物

摘 要 目的:探讨荧光定量PCR联合检测性病病原体的临床价值。方法:用荧光定理PCR(FQ-PCR)方法,对淋球菌(NGH)、沙眼衣原体(CT)、解脲支原体(UU)、梅毒螺旋体(TP)4种性病病原微生物进行定量测定,并与定性PCR比较。结果:两种PCR方法对NGH、CT、UU、和TP四种病原体检测的总符合率分别为94.83%、89.02%、95.79%、和95.65%,阳性率差异分别为1.72%、1.22%、2.11%和0,两种方法阳性率差异均无显著性意义(P>0.05)。阳性标本定量平均拷贝数对数分别为6.71±3.36、5.56±2.48、6.83±3.17和4.89±3.52。结论:FQ-PCR操作简便、快速,并能准确定量。对于性传播疾病的诊断、病情的发展和预后监测、疗效评价、指导用药均具有很高临床应用价值。

关键词 聚合酶链式反应 荧光定量 病原微生物

doi:10.3969/j.issn.1007-614x.2010.22.200

荧光定量PCR(FQ-PCR)检测技术融汇了PCR技术高效的核酸扩增,探针杂交技术的高敏感、高精致定量的优点。完全封闭操作,仪器直接读取PCR荧光信号的变化以获得定量的结果,定量范围(可包括0～108个基因拷贝/μl);并能克服常规PCR仅能定性无法定量、溴化乙锭染色剂对人潜在致癌污染环境等缺点。目前扩增不同的目的DN段通常有不同的扩增温度条件[1],FQ-PCR在同一条件下联合扩增检测多种病原微生物的报道较少。流行病学调查显示,我国性传播疾病(STD)发病率正逐年上升[2]。选择快速、敏感、特异的检测手段STD的治疗和整体控制非常重要。

资料与方法

2007年2月～2009年2月收治妇科、泌尿外科、皮肤性病门诊临床泌尿生殖系统感染以及怀疑性传播疾病(STD)或自述有高危接触史患者620例,其中男256例,年龄17～58岁,平均36岁;女364例,年龄16～49岁,平均26岁。

检测仪器和试剂:Presonal cycler基因扩增(德国Biometra),DA260型荧光定量测定仪(上海棱光);荧光定量PCR试剂由广州达安基因公司提供,PCR定性试剂由洛阳华美公司提供。

方法:①模扳制备:男性尿道拭子或女性宫颈及阴道分泌物拭子放1.5ml无菌生理盐水(NS)的无菌试管中,在旋涡振荡器上混匀3份,将混悬液倒入1.5ml 12000rpm/分5份,弃上清,沉淀加等体积(一般50μl)DNA提取液,充分混匀后置沸水浴10分钟,冷却后10000rpm/分5分,取上清2μl加入荧光定量扩增管进行扩增。②PCR扩增:93℃预变性120S,然后按93℃ 45秒,55℃ 120秒2个循环,3分钟后取出迅速放入荧光检测仪做标本底荧光测定,然后按93℃ 45秒,38个循环后置33保温,20分钟内进行荧光强度检测,结果超过5×102拷贝/μl为阳性。定性PCR扩增条件:取5μl至40μlPCR反应体系,98℃预变性180秒,加入2Μtaq酶,92℃ 30秒,54℃ 45秒,72℃ 60秒,35个循环,72℃ 5分。扩增产物取10μl进行琼脂糖电泳,电泳结束置紫外透照仪下参照阳性Maker 观察比对荧光条带结果。