单色多重荧光实时定量PCR测定端粒长度

[摘要] 目的 在罗氏LightCycler 480上建立单色多重荧光实时定量聚合酶链反应（MMQPCR）方法测定端粒长度。 方法 在罗氏480定量PCR仪上使用MMQPCR方法测定39例人外周血白细胞端粒长度（相对T/S比值），并与DNA印迹法（Southern blot）测得的平均末端限制性片段（TRF）长度作比较。 结果 MMQPCR方法测定端粒长度相对T/S比值为1.13±0.21，Southern blot方法测量平均TRF长度为（7.46±1.21）kb，两种方法测定结果的相关性分析R2 = 0.6706（P < 0.001）。 结论 本研究建立的MMQPCR方法测定端粒长度重复性好、省时、简便、可靠，可高通量处理大量样品。

[关键词] 端粒长度；多重定量PCR；T/S比值；末端限制性片段

[中图分类号] R34 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2016）07（a）-0014-04

[Abstract] Objective To establish a monochrome multiplex real-time quantitative polymerase chain reaction （MMQPCR）， for telomere length measurement on the Roche LightCycler 480 （LC480） real-time PCR platform. Methods Telomere lengths （T/S ratio） were measured from 39 DNA samples extracted from human white blood cells using the MMQPCR method on the LC480 platform， and were compared with terminal restriction fragment （TRF） lengths measured by Southern blot. Results Relative T/S ratio measured by MMQPCR was 1.13±0.21， and mean TRF length was （7.46±1.21） kb. The correlation coefficient （R2） for the relationship of the two different methods was 0.6706 （P < 0.001）. Conclusion The MMPQPCR method is reproducible， rapid， and simple， thus reliable for a high throughput of samples.

[Key words] Telomere length； Multiplex quantitative PCR； T/S ratio； Terminal restriction fragment

有研究表明，端粒长度是生物学老化的标志[1]，端粒缩短被认为与多种心脑血管病的发生及进展有关[2-5]。端粒长度的测定方法最早由Harley等[6]在1990年提出，即通过Southern blot测定末端限制性片段（TRF）的长度，该方法虽然过程繁琐，所需DNA量大，但至今仍是端粒长度测量方法的“金标准”。随后人们提出了定量荧光原位杂交（Q-FISH）[7]和建立流式荧光原位杂交（Flow-FISH）[8]（流式荧光原位杂交）。2002年，Cawthon[9]首创了荧光定量PCR测定端粒相对长度的方法，即通过计算端粒拷贝数（T）与单拷贝基因拷贝数（S）的比值T/S来反映平均端粒长度，但该方法中端粒DNA和单拷贝基因的扩增是在不同的反应管中进行，使得模板起始量的不同对结果的变异产生重要影响，为解决这一问题，2009年，Cawthon[9]还提出了单色多重定量PCR方法（MMQPCR）[10]。该方法对荧光定量PCR仪有一定要求，即能够在一个循环中两次收集SYBR Green荧光信号，而国内外实验室使用较多的ABI系列如7900HT、7700等无此功能。因此，目前研究者仍普遍采用Cawthon[11]于2002年提出的定量PCR方法测定端粒长度。罗氏480（LightCycler480）荧光实时定量PCR仪被广泛应用于诊断和研究，但文献中较少见到其被用于测定端粒长度[11-13]，本文参照Cawthon[9]2009提出的MMQPCR，优化实验中的参数，阐述在罗氏480实时定量PCR仪上建立MMQPCR的过程，并与传统的Southern blot方法测量平均TRF长度作相关性分析。

1 材料与方法

1.1 材料

实验标本选自2013年11月1～30日南京医科大学附属淮安第一医院（以下简称“我院”）检验科体检者的肘静脉新鲜EDTA抗凝血2 mL，共40例，其中男19例，女21例，年龄38～79岁，平均（61.46±11.58）岁。本研究获得我院医学伦理委员会审查通过，所有入选者均签署知情同意书。

1.2 方法

1.2.1 单色多重荧光实时定量PCR测定端粒长度 使用富士核酸提取系统提取基因组DNA，操作严格按照说明书进行。微量紫外分光光度计测DNA的浓度与纯度，OD260/280为1.7～1.9为合格，记录DNA的浓度。使用TB缓冲液将待测样本DNA浓度稀释至7 ng/μL，任意选取一样本作为标准品，使用Milli-Q超纯水按1U2.5的比例将标准品DNA浓度依次等比稀释为45、18、7.2、2.88、1.152 ng/μL，并放于-20℃冰箱保存备用。端粒长度的测定参照Cawthon2009年提出的MMQPCR[7]。反应使用的引物由英潍捷基（上海）贸易有限公司合成，序列如下：telg 5′-ACACTAAGGTTTGGGTTTGGGTTTGGGTTTGGGTTAGTGT-

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（收稿日期：2016-03-21 本文编辑：任 念）