基因SCN1A rs3812718多态性与桂西地区难治性癫痫相关性的研究

【摘要】目的研究基因SCN1A rs3812718多态性与桂西地区难治性癫痫（RE）的关系。

方法收集诊断明确并且规范化治疗的桂西地区癫痫患者109例，根据RE的诊断标准将其分为RE组（38例）和非RE组（71例）。利用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDITOFMS）技术检测患者外周血基因SCN1A rs3812718 的多态性，评估两组患者不同基因型和等位基因与难治性癫痫患病风险的关联性。

结果RE组AA、GA、GG基因型分别占5.3%、52.6%、42.1%，非RE组分别占9.9%、38.0%、52.1%，两组比较差异无统计学意义（P>0.05）。RE组患者rs3812718等位基因A、G频率分别占31.6%、68.4%，非RE组A、G频率分别占28.9%、71.1%，两组比较差异无统计学意义（P>0.05），两组患者不同基因模型比较差异无统计学意义（P>0.05）。

结论未发现基因SCN1A rs3812718 多态性与桂西地区RE易感性有关。

【关键词】SCN1A基因；基因多态性；难治性癫痫；桂西地区

中图分类号：R742.1文献标识码：ADOI：10.3969/j.issn.10031383.2017.02.001

【Abstract】ObjectiveTo study correlation between polymorphism of gene SCN1A rs3812718 and human refractory epilepsy（RE） in western Guangxi.

Methods109 cases of epilepsy with clear diagnosis and standardized treatment in western Guangxi were collected and divided into RE group （38 cases） and non RE group （71 cases） according to the diagnostic criteria of RE.MatrixAssisted Laser Desorption/Ionization Time of Flight Mass Spectrometry（MALDITOFMS） was used to detect polymorphism of gene SCN1A rs3812718 in peripheral blood，and correlation between different genotypes and alleles with the risk of RE in the two groups was evaluated.

ResultsAA，GA and GG genotypes in the RE group accounted for 5.3%，52.6%，and 42.1%，respectively，and that of the non RE group accounted for 9.9%，38.0% and 52.1%，respectively，difference was not statistically significant（P>0.05）.Allele A and G frequency of rs3812718 in the RE group accounted for 31.6% and 68.4% respectively，and that of the non RE group accounted for 28.9% and 71.1% respectively，difference was not statistically significant（P>0.05）.Difference of different gene models between the two groups was not statistically significant（P>0.05）.

ConclusionNo relation between polymorphism of gene SCN1A rs3812718 and susceptibility to RE in western Guangxi is found.

【Key words】gene SCN1A；genetic polymorphism；RE；western Guangxi

d痫是一种以神经元异常放电导致中枢神经系统功能失常的疾病，近年来尽管在药物治疗方面取得巨大进步，开发很多抗癫痫新药，但是仍有30%左右癫痫患者对抗癫痫药物（antiepileptic drugs， AEDs）不敏感甚至耐受，发展为难治性癫痫（refractory epilepsy，RE），原因在于RE的耐药机制不完全清楚[1]。研究表明癫痫发病机制是编码电压门控性Na+通道的相关基因突变所致，其中与编码α亚基的SCN1A 基因突变的关系非常密切，如Dravet综合征 （DS）、全身泛化性癫痫伴发热综合征（GEFS+）等发病机制与SCN1A 基因突变密切相关。基因SCN1A rs3812718突变可直接导致不同类型、轻重程度不同的癫痫[2～3]，可能导致控制癫痫所需的药物剂量增加[4]，甚至造成对某些抗癫痫药物抵抗[5]，但也有学者研究发现该位点突变与癫痫耐药无关[6]。既往研究发现桂西地区癫痫发病率及患病率均高于全国平均水平，农村地区占 2/3[7]。为了进一步探讨该地区癫痫发病的原因，有效地开展预防工作，本研究利用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDITOFMS）技术分析研究电压门控性Na+通道基因SCN1A rs3812718多态性与桂西地区RE易感性的关系。

1资料与方法

1.1研究对象

选取2015年1月至2016年8月就诊于右江民族医学院附属医院的住院或门诊癫痫患者109例。入组标准：①符合国际抗癫痫联盟 2001年制定的癫痫和癫痫综合征的分类标准[8]， 根据发作类型选择适合的AEDs治疗，药物种类不做要求；②桂西地区户籍；③规范化的AEDs治疗；④自愿同意进入本研究，签订知情同意书。排除标准：①晕厥、假性癫痫发作、低血糖、发作性睡病等发作性疾病；②存在脑肿瘤、进行性加重的脑部疾病和神经系统退行性变；③合并严重心、肝、肾等重要器官功能障碍者；④有精神病史或家族史；⑤明显的智力障碍患者。RE诊断标准：按照患者的发作类型，适当的第一线抗癫痫药物规范治疗且药物的血药浓度在有效范围内，仍不能控制发作且影响日常生活，无进行性中枢神经系统疾病或占位性病变。按照RE标准分为RE组和非RE组，其中RE组38例，非RE组71例。

1.2方法

1.2.1基因组DNA提取

抽取患者外周静脉血3 ml于血清管中，经3500 rpm离心5 min，用下层血凝块提取 DNA，放置-80℃保存，并采用紫外分光光度仪测定DNA纯度，其A260/A280范围在1.6至2.0之间。

1.2.2PCR扩增及纯化

Pubmed中检索基因SCN1A的全序列，使用Assay Designer（Sequenom）软件设计引物，rs3812718前后引物分别为：5’ACGTTGGATGTCAGCTCTTCGCACTTTCAG3’和5’ACGTTGGATGGTGACGTACCTGTAATAGGG3’。PCR反应体系：所需DNA样本稀释至20 ng/μL，取1 μL DNA样本，并与1.850 μL水、0.325 μL的25 mmol/L MgCl2、0.625 μL PCR冲液（含15 mmol/L MgCl2）、0.100 μL的25 mmol/L dNTP、1 L PCR引物以及0.1 μL HotStar Taq（Qiagen）酶混合在一起。PCR反应条件为94℃ 5 min，94℃ 20 s，56℃ 30 s，进行45个循环，最后72℃ 3 min。PCR扩增后，剩余的dNTP将被去磷酸降解，反应体系包括1.53 μL水、0.17 μL SAP缓冲液、0.3单位碱性磷酸酶（Sequenom）。该反应在37℃进行20 min，而后85℃ 5 min，最终使酶失去活性。

1.2.3延伸反应

SCN1A rs3812718特异的延伸引物为：5’GCCTATCCTTTACTCTAATCACTT3’，反应体系：0.619 μL水、0.2iPLEX缓冲液、0.2 μL终止混合物、0.940 μL 延伸引物（Sequenom）。在94℃ 30 s，94℃ 5 s，52℃ 5 s，80℃ 5 s，进行5个步骤，共行40次循环后，产物于72℃ 3 min。在最终反应产物里均匀填充阳离子交换树脂（Sequenom）脱盐，混合后加入16 μL悬浮。

1.2.4样本分析

使用MassARRAY Nanodispenser RS1000点样机（Sequenom）将最终的分型产物点样于384孔spectroCHIP bioarray芯片（Sequenom）上，将点样后的SpectroCHIP芯片使用MALDITOFMS技术对基因多态性进行检测，最终由MassARRAY Typer4.0软件系统完成基因分型分析。

1.2.5等位基因判别

通过MALDITOFMS检测，计算产物峰值与相应的引物峰值之间的质荷比，得知所延伸的类型，可推断该位点的基因型。见表1。

1.3统计学方法

运用SPSS 22.0统计软件进行数据分析，应用χ2检验评估 RE组与非RE组以及所有患者基因型的分布是否符合HardyWeinberg平衡（HWE）；应用Pearson χ2检验，比较两组患者基因型频率和等位基因频率的差异，检验水准：α=0.05。

2结果

2.1基因型特征质谱图

基因SCN1A rs3812718的杂合子GA型在G和A等位基因处均有信号强度峰，纯合的GG、AA基因型则只在G、A等位基因处有信号强度峰值。见图1。

2.2HardyWeinberg遗传平衡检验

分别对基因SCN1A rs3812718在RE组、非RE组所有患者中的基因型频率分布进行HWE检验，差异均无统计学意义（P>0.05），结果各基因型的分布频率符合HWE，说明选取的样本具有代表性。见表2。

2.3基因SCN1A rs3812718基因型分布和等位基因频率比较

RE组与非RE组基因SCN1A rs3812718基因型分布比较差异无统计学意义（P>0.05），两组基因SCN1A rs3812718等位基因频率比较差异无统计学意义（P>0.05）。见表3。分别比较RE组与非RE组患者每个基因型别，差异均无统计学意义（P>0.05）；单独比较两组患者中基因型AA和GG，亦无统计学意义（P>0.05）。见表4。

3讨论

癫痫发病机制的功能学核心是神经元异常放电，而电压门控性Na+通道结构和功能改变在神经元动作电位产生与传播过程中发挥着关键性作用，是神经元异常放电的电生理学基础，与癫痫发生发展有着密切联系。电压门控性Na+通道由一个α大亚基和两个β小亚基构成的跨膜蛋白，α大亚基是具有高度保守遗传性的功能性亚基，β亚基只有通过与α亚基结合才具有Na+通道活性作用，为此对电压门控性Na+通道的研究主要集中在α亚基。目前已鉴定出人类的α亚基有9种不同的异构体，即编码基因SCN1A、SCN2A、SCN3A、SCN4A、SCN5A、SCN8A、SCN9A、SCN10A、SCN11A。SCN1A是电压门控性Na+通道α亚基的编码基因，定位于2号染色体长臂（2q24.3），该基因的突变可改变Na+通道的结构和功能，直接造成癫痫的发生或是影响抗癫痫药对神经细胞作用，导致难治性癫痫形成[9]。国内学者研究发现，SCN1A IVS5N+5G>A基因多态性与卡马西平耐药性癫痫有关，提示 SCN1A IVS5N+5G>A基因突变可能通过改变钠通道蛋白的表达，使得卡马西平作用靶点功能下降， 从而导致卡马西平治疗无效或者有效治疗剂量的改变[10]；国外学者研究发现，SCN1A IVS5N+5G>A 突变纯合子需要更高的卡马西平剂量治疗，或治疗无效[11]；对汉族癫痫患者研究发现 SCN1A 基因第 5 外显子的SNP rs3812718的点突变与卡马西平治疗个体差异存在一定关系，同时发现亚洲人该位点突变发生率较高[4]。这些研究结果表明SCN1A 基因多态性与癫痫的难治性密切相关，同时该基因突变可能与种族、地域的差异有关。

关于基因SCN1A rs3812718多态性与RE的关系，目前尚存在争议。既往有学者研究发现，若想控制癫痫的发作，基因SCN1A rs3812718的AA型癫痫患者往往较GG型患者需要服用更多的卡马西平，并得出了SCN1A rs3812718 A等位基因治疗癫痫的药物维持剂量应大于G等位基因的患者[4]。但是更多学者的研究结果并没有发现SCN1A rs3812718与耐药性存在关系[12]。有研究在同一样本、不同的基因模型下会得出不同结论的情况[13]。之所以存在这些研究结果，可能是因为存在样本量、种族、实验方法、病例纳入标准等条件不同。本研究中，采用国际认可的RE诊断标准，观察和分析了38位RE患者、71位非RE患者SCN1A rs3812718基因多态性，发现RE组中GG基因型、G等位基因频率虽然高于非RE组，AA基因型、A等位基因频率低于非RE组，但通过统计学分析，发现这些差异均无统计学意义，不同基因模型下同样未发现有统计学差异，本研究结果提示，基因SCN1A rs3812718多态性与桂西地区RE的发生可能不存在联系。但是考虑到桂西地区为多民族聚居地、气候属亚热带，每年五、六月份持续 38℃高温，大量铝土矿开采，露天暴露，造成严重的空气污染，基于这些地理环境、气候条件、民族分布等基因突变可能存在较大影响，如果要得到更可靠的结论，必须扩大样本、细分民族，分析气候环境的影响，以全面深入了解各种因素作用的方式及效应，才有可能阐明发病机制，有效地开展预防工作。

参考文献

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（收稿日期：2017-02-24修回日期：2017-04-07）

（辑：梁明佩）

基金项目：广西自然科学基金（2014GXNSFAA118215）

作者简介：钱哲，男，在读硕士研究生，研究方向：难治性癫痫的基础与临床。Email：

通信作者：黄建敏。Email：