黄瓜NRT2基因的鉴定和特征分析

摘要：本研究利用生物信息学方法，从黄瓜基因组中鉴定出3个NRT2基因，并对这些基因的基因组分布、结构、遗传进化和顺式元件进行了系统分析。结果显示，黄瓜的NRT2基因分别位于1号、1号和5号染色体，具有2个或3个外显子，分别与拟南芥的NRT2.4或者NRT2.5直系同源；它们都具有数个植物激素和逆境应答元件，暗示它们不仅在氮素吸收过程中具有一定功能，而且与植物逆境应答有关。该结果为进一步研究黄瓜NRT2的功能提供了线索。

关键词：黄瓜；硝态氮转运蛋白NRT2； 分子特征；系统进化；顺式元件

中图分类号：S642.201文献标识号：A文章编号：1001-4942（2016）06-0011-04

氮素是植物必需的大量元素之一，对作物生长起着非常重要的作用，它是植物体蛋白质、核酸、叶绿素的组成部分。施用氮肥不仅能提高农产品产量，还能提高农产品质量[1]。硝态氮是植物利用土壤中氮素的主要形态。植物对硝态氮的吸收主要通过硝态氮转运蛋白进行[2，3]。植物硝态氮转运蛋白主要分为低亲和性和高亲和性两种[4，5]。在模式植物拟南芥中，NO-3的转运是通过硝态氮转运蛋白NRT1、NRT2和NRT3调控的[6～8]。NRT1家族为低亲和性转运蛋白，NRT2为高亲和性转运蛋白，而NRT3不具有转运功能，主要是通过调控NRT2基因来发挥作用[9]。它们在氮素吸收转运、根系发育、生物和非生物逆境应答过程中具有重要功能[10～16]。

黄瓜是我国主要设施栽培蔬菜之一，在蔬菜生产中具有重要地位。研究黄瓜氮素吸收机理，有助于合理施肥，提高黄瓜氮肥利用效率，减少环境污染。目前，有关黄瓜氮素吸收的研究已有报道，姚娟等报道了亚适温对4个黄瓜NRT基因和1个AMT基因表达的影响[17]；赵春波等研究了北方地区不同黄瓜品种氮素吸收与利用效率的差异[18]；Migocka等研究了黄瓜NRT1家族的组织表达特异性及与拟南芥、水稻等NRT1基因在结构和数量上的差异[19]；Nikolic等研究认为黄瓜叶片中硝态氮的转运与细胞膜上ATPase的活性和数量有关[20]；Li等研究了黄瓜硝酸还原酶在缺氮条件下的分子特征[21]；秦智伟等克隆了黄瓜的NRT1.5基因，并对其表达进行了分析[22]。但是有关黄瓜NRT2的研究较少，本研究利用生物信息学方法鉴定出3个黄瓜NRT2基因，并对其分子结构特征、遗传进化和顺式调控元件进行了系统分析，为将来研究黄瓜NRT2基因的功能提供线索。

1材料与方法

用已鉴定的拟南芥NRT2基因序列搜索黄瓜基因组数据库（http：//.cn/page /cucumber/blast.jsp）和NCBI数据库，寻找黄瓜新的NRT2基因。利用BLASTP在拟南芥数据库TAIR中进行序列比对，确定黄瓜NRT2基因与拟南芥NRT2基因的关系。利用Motif Scan（http：//myhits.isb-sib.ch /cgi-bin/motif_scan） 对黄瓜NRT2基因编码的蛋白进行保守基序和结构预测分析，并根据编码区序列信息对其进行染色体定位。利用Mega 4.1对黄瓜NRT2基因进行系统进化分析。通过NRT2编码区和基因组序列比对来显示基因外显子和内含子的结构组成，得到各个NRT2基因起始密码子ATG上游1 500 bp的启动子区及上游序列。顺式元件预测采用PlantCARE软件（http：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcareplantcare/html/）进行在线分析。亚细胞定位预测在WoLFPSORT （http：///） 中进行。

2结果与分析

2.1黄瓜NRT2的鉴定和分子特征

通过对黄瓜基因组数据库和NCBI数据库黄瓜基因的挖掘和分析，笔者鉴定出3个黄瓜NRT2基因Csa017175、Csa017221和 Csa000871（表1）。这3个基因分别位于黄瓜的1号、1号和5号染色体上。基因结构分析表明，它们含有2个或者3个外显子，亚细胞定位预测结果显示它们均定位于细胞膜上（图1）。

2.2黄瓜NRT2基因的遗传进化和编码蛋白的基序分析

通过对黄瓜NRT2基因遗传进化分析和不同物种间同源序列比对显示，Csa000871与拟南芥的NRT2.5直系同源，Csa017221和Csa017175与拟南芥的NRT2.4直系同源（图2）。而且，Csa017221和Csa017175紧密连锁，编码区大小和结构一致，二者序列一致性极高，达99.62%，编码蛋白的序列一致性高达99.25%。它们的蛋白基序除了一个酰胺化位点的差异外，其余基序的类型和数目相同（表2）。Csa000871编码的蛋白与上述两个蛋白在基序类型上相似，但在基序数量上有所不同，根据结构决定功能的生物学特性，推测黄瓜的3个NRT2基因在功能上存在一定差异。

2.3黄瓜NRT2的顺式元件及功能预测

通过对顺式调控元件的分析得出，黄瓜NRT2基因的上游序列中存在多个逆境和激素应答顺式调控元件，且各不相同（表3）。在Csa017175上游序列中分别存在1个ABA 应答元件ABRE、乙烯应答元件ERE、赤霉素应答元件TATC-box、水杨酸应答元件TCA-element；Csa017221分别存在1个病原物应答元件Box-W1、茉莉酸甲酯应答元件CGTCA-motif、赤霉素应答元件GARE-motif、防卫应答元件W-box，还分别有2个热胁迫应答元件HSE、2个水杨酸应答元件TCA-element以及3个逆境和防卫响应元件TC-rich repeats；Csa000871分别有1个赤霉素应答元件TATC-box、1个逆境和防卫响应元件TC-rich repeats、2个病原物应答元件Box-W1、2个防卫应答元件W-box、4个水杨酸应答元件TCA-element。虽然，Csa017175和 Csa017221在核酸和编码蛋白的序列一致性上高达99%，但它们的顺式调控元件差异较大，暗示它们在功能上存在分化。根据顺式调控元件分析和进化分析的结果，推测Csa000871在氮素吸收以及再分配及生物逆境胁迫应答中具有一定功能，而Csa017175和Csa017221对缺氮条件下植物根和地上部氮素的吸收具有双重功能。此外，Csa017175还参与ABA、乙烯和水杨酸及赤霉素信号应答，而Csa017221在病原物胁迫和防卫应答、热胁迫、赤霉素、水杨酸及茉莉酸甲酯信号应答中具有一定功能。其实际功能需要进一步试验验证。

3结论

本研究通过对鉴定出的3个黄瓜NRT2基因的系统分析，发现它们分别位于1号、1号和5号染色体上，具有2个或者3个外显子，分别与拟南芥的NRT2.4或者NRT2.5直系同源。黄瓜3个NRT2编码的蛋白除了Csa017221含有一个酰胺化位点外，其它基序类型都相同，但在数目上有差异。Csa017221 和Csa017175在结构上相似，序列上几乎一致，但它们上游顺式调控元件差异较大，说明它们的表达调控有所不同。黄瓜的NRT2基因都具有数个植物激素和逆境应答元件，暗示它们不仅在氮素吸收过程中具有一定功能，而且与植物逆境应答有关。本研究为进一步探明黄瓜NRT2的功能提供了线索。

参考文献：

[1]陈雅君，闫庆伟，张璐，等.氮素与植物生长相关研究进展[J].东北农业大学学报，2013，44（4）： 144-148.

[2]马清，管超，夏曾润，等.高等植物氮素转运蛋白研究进展[J].兰州大学学报（自然科学版），2015，51（2）：217-227.

[3]张鹏，张然然，都韶婷.植物体对硝态氮的吸收转运机制研究进展[J].植物营养与肥料学报，2015，21（3）：752-762.

[4]段娜，章尧想，刘芳，等.植物氮素吸收及其转运蛋白研究进展[J].分子植物育种，2015，13（2）：461-468.

[5]Yong Z， Kotur Z， Glass A D. Characterization of an intact two-component high-affinity nitrate transporter from Arabidopsis roots [J].Plant J.，2010，63（5）：739-748.

[6]Krouk G， Tillard P， Gojon A. Regulation of the high-affinity NO3- uptake system by NRT1.1-mediated NO3- demand signaling in Arabidopsis[J].Plant Physiol.，2006， 142（3）：1075-1086.

[7]Okamoto M，Vidmar J J，Glass A D. Regulation of NRT1 and NRT2 gene families of Arabidopsis thaliana： responses to nitrate provision[J]. Plant Cell Physiol.，2003，44（3）：304-317.

[8]Li W，Wang Y，Okamoto M， et al.Dissection of the AtNRT2.1：AtNRT2.2 inducible high-affinity nitrate transporter gene cluster[J].Plant Physiol.，2007，143（1）：425-433.

[9]Okamoto M，Kumar A，Li W， et al.High-affinity nitrate transport in roots of Arabidopsis depends on expression of the NAR2-like gene AtNRT3.1[J].Plant Physiol.，2006，140（3）：1036-1046.

[10]Chopin F，Orsel M，Dorbe M F， et al. The Arabidopsis ATNRT2.7 nitrate transporter controls nitrate content in seeds [J].Plant Cell，2007，19（5）：1590-1602.

[11]Lezhneva L， Kiba T， Feria-Bourrellier A B， et al.The Arabidopsis nitrate transporter NRT2.5 plays a role in nitrate acquisition and remobilization in nitrogen-starved plants[J].Plant Journal， 2014， 80（2）：230-241.

[12]Kiba T， Feria-Bourrellier A B， Lafouge F， et al.The Arabidopsis nitrate transporter NRT2.4 plays a double role in roots and shoots of nitrogen-starved plants[J].Plant Cell，2012，24（1）：245-258.

[13]Zheng D，Han X，An Y I， et al.The nitrate transporter NRT2.1 functions in the ethylene response to nitrate deficiency in Arabidopsis [J].Plant Cell Environ.，2013，36（7）：1328-1337.

[14]Camaes G， Pastor V， Cerezo M， et al.A deletion in the nitrate high affinity transporter NRT2.1 alters metabolomic and transcriptomic responses to Pseudomonas syringae [J]. Plant Signal Behav.，2012，7（6）：619-622.