用蛋白芯片技术筛选膝骨性关节炎不同中医证型患者血清中标志蛋白

摘要：目的：利用蛋白芯片技术和生物信息学方法从膝骨性关节炎患者血清中筛选标志蛋白质。方法：采用表面增强激光解吸电离飞行时间质谱技术(surfaced enhanced laser desorpfion/ion/zafion time of flight mass spec-troscopy)和弱阳离子交换(CMIO)蛋白芯片对30例肝肾亏虚型膝骨性关节炎患者、35例气滞血瘀型膝骨性关节炎患者血清和40例健康者血清的蛋白质谱图进行了检测，获得的蛋白质谱采用Ciphergen公司的Biomarker Wiz-ard和Biomarker Pattern软件分析。结果：肝肾亏虚型膝骨性关节炎患者与健康者血清蛋白质谱相比有18个显著差异蛋白质(P

关键词：膝骨性关节炎；中医证型；蛋白芯片

中图分类号：R684.3　文献标识码：A　文章编号：1673-7717(2009)05-0934-03

膝骨性关节炎中国传统医学称为“膝骨痹”，源于《内经》“病在骨，骨重不可举，骨髓酸痛，名日骨痹”。膝骨痹病名最早见于孙思邈《备急千金要方》。膝骨痹由于年老体衰，骨失滋养，气血失调，致局部或全身骨关节退化改变。临床表现以大关节疼痛、活动受限为主症。膝骨性关节炎是多因素性疾病，病因较为复杂。本研究采用表面增强激光解离飞行时间质谱技术(surface－enhancedlaser desorp-tion/ionization time of ftighl mass spectrometry，SELDI-TOF－MS)。运用CM10蛋白质芯片对膝骨性关节炎患者按中医证型进行研究。探索其血清中的蛋白质指纹图谱，希望发现一些特异性的差异蛋白，从而对膝骨性关节炎的病因、诊治有所帮助。

1　对象与方法

1.1　临床资料

1.1.1　一般资料　65例患者均为台州市立医院骨科住院与门诊常规中医辨证治疗的膝骨性关节炎患者，其中30例为肝肾亏虚者，35例为气滞血瘀者。健康者40例，均为体检正常的健康志愿者。血清分离后储存于-80℃低温冰箱中。

1.1.2　诊断标准　①近1个月内经常反复膝关节疼痛；②X线(站立或负重位)，关节间隙变窄、软骨下骨硬化或囊性变、关节缘骨赘形成；③关节液(至少抽取2次)清亮、黏稠，WBC

1.1.3　中医分型　①肝肾亏虚：关节隐隐作痛，腰膝酸软，腰腿不利，俯仰转侧不利。伴有头晕，耳鸣，耳聋，目眩，舌淡红，苔薄白，脉细。②气滞血瘀：关节刺痛，痛处固定，关节畸形，活动不利，或腰弯背驼，面色晦暗，唇舌紫黯，脉沉或细涩。

1.1.4　纳入标准　①符合膝骨性关节炎西医诊断标准者；②符合膝骨性关节炎中医辨证诊断标准属气滞血瘀、肝肾亏虚证者；③45岁以上患者；④4周内未作糖皮质激素及其他口服药物治疗者。

1.1.5　排除标准　①不符合上述诊断标准者；②中医证候分类不属“气滞血瘀、肝肾亏虚”型者；③年龄小于45岁者；④4周内使用糖皮质激素及其他口服药物治疗者；⑤合并严重心脑血管、肝、肾、造血系统疾患者；⑥孕妇；⑦合并类风湿关节炎、痛风、关节结核、化脓性关节炎、大骨节病者。

1.2　研究方法

1.2.1　仪器和芯片　蛋白质芯片阅读机为PBS－IIC型SELDI-TOF-MS系统，芯片选用CM10蛋白质芯片(美国BIO－RAD生物公司)。

1.2.2　样本处理　血清标本冰浴溶解后在40℃ 10000r/min离心10min，取10μL加入预先配置好的20μLU9[9mol/L尿素，2％(体积分数)s－环乙氨－1－丙磺酸，50mmol/L Tris盐酸，pH9.0]，4℃振荡反应30min，2000r/min离心5min取上清液10μL，快速加入110wL结合缓冲液(50mmol/LNaAc，pH4.0)。取出芯片每孔加入200μL的结合缓冲液，室温下400～600r/min震荡5min，甩去缓冲液，重复1次。取处理好的血清100μL上样到芯片处理器，4℃400～600r/min震荡1h，甩出样品，每孔加入200μL的结合缓冲液室温下400～600r/min震荡5min，甩去孔中液体重复操作1次。每孔加入200μL高纯去离子水，立即甩出后，即刻拆开芯片处理器，取出芯片，待干后每孔加入能量吸收物质[50％(体积分数)乙腈+0.5％(体积分数)三氟乙酸]0.5μL到已经结合上蛋白质的CM10芯片上，重复加能量吸收物质0.5μL1次，上机检测。

1.2.3　数据采集　蛋白质芯片采用蛋白质芯片阅读机PBSU－c型读取数据。仪器每天用标准多肽和低于200kD的蛋白质标准分子校正，系统的质量偏差为0.1％。检测芯片时蛋白质芯片阅读机设置如下：激光强度195，检测敏感度8，优化分子质量范围2～20kD，最高分子量150kD，每个样品收集64个点。获取蛋白指纹图谱。

1.2.4　生物信息学方法分析采用Ciphergen proteinehlp3.0.2版本的分析软件自动采集数据，采用Biomarker Wizard和Biomarker Pattern软件分析患者和正常对照组血清的差异蛋白。

2　结果

(1)肝肾亏虚型膝骨性关节炎患者与健康者血清蛋白指纹图谱相比有18个差异蛋白。将患者和健康者血清样品加样于CMIO蛋白质芯片上，采用SELDI-TOF(PBSII－c型蛋白质芯片阅读机)分析，自动收集蛋白质峰，设有意义峰的最低信噪比为5，最低出现频率阈值为30％，再用Biomarker Wizard软件对所有测得蛋白质谱统一进行标准化后，对患者和健康者血清中蛋白质峰的数量和相对强度进行比较与统计分析，结果显示，每个谱图平均有108个蛋白质峰，其中有18个蛋白具有显著性差异(P

(2)气滞血瘀型膝骨性关节炎患者与健康者血清蛋白

指纹图谱相比有22个差异蛋白。用Biomarker Wizard软件对所有测得蛋白质谱统一进行标准化后，对患者和健康者血清中蛋白质峰的数量和相对强度进行比较与统计分析，结果显示，有20个蛋白具有显著性差异(P

(3)肝肾亏虚型膝骨性关节炎患者和气滞血瘀型膝骨性关节炎患者与健康者血清蛋白指纹图谱相比有5个蛋白均下调(5957 Da、2026 Da、5932 Da、2958 Da、5257 Da)，1个蛋白上调(8132 Da)，可见这6个蛋白可能是膝骨性关节炎特有的差异蛋白。

(4)肝肾亏虚型膝骨性关节炎患者与气滞血瘀型膝骨性关节炎患者相比具有5个显著性差异蛋白(P

3　讨论

膝骨性关节炎中国传统医学称为“膝骨痹”，源于《内经》“病在骨，骨重不可举，骨髓酸痛，名日骨痹”。膝骨痹病名最早见于孙思邀《备急千金要方》。膝骨痹由于年老体衰，骨失滋养，气血失调，致局部或全身骨关节退化改变。临床表现以大关节疼痛，活动受限为主症。

膝骨性关节炎是多因素性疾病，本病病因主要有以下几个方面：年龄、性别、遗传、关节损伤(包括急慢性损伤)、关节疾病(多为继发性)、气候因素、饮食因素等，病因较为复杂。中医认为，肝肾亏虚、筋骨失养是膝骨性关节炎发病的根本，气滞血窟、痰凝是其发病的重要环节，风寒湿痰外邪侵袭、痹阻经络是其发病的重要因素。近年来随着医学蛋白质组学的发展，人们从蛋白质方面对疾病的研究又有了新的认识。

SELDI技术是近年来发展起来的新的生物检测技术，它具有高度并行性、高通量、微型化和自动化的特点使其成为研究蛋白质组学的有力工具。由于可以同时检测大量蛋白质的存在，该技术已广泛应用于人体血清、尿液等体液中疾病相关标志物的筛查识别上，并发现一些特异性蛋白标志物可用于临床早期诊断和治疗效果监测。相对于已广泛应用的双向凝胶电泳技术，SELDI技术所检测的相对分子质量范围一般在20000Da以下。目前国内外还未见SELDI-TOF用于膝骨性关节炎方面的研究。

本实验利用SELDI技术及配套的CM10芯片来检测膝骨性关节炎患者不同中医诊断分型的相关蛋白群。根据实验结果证实，膝骨性关节炎组与健康组相比血清中存在蛋白质的差异，肝肾亏虚型膝骨性关节炎患者与健康者血清蛋白指纹图谱相比有18个差异蛋白，气滞血瘀型膝骨性关节炎患者与健康者血清蛋白指纹图谱相比中有22个差异蛋白。其中在这两型膝骨性关节炎患者与健康组相比中有5957Da、2026Da、5932Da、2958Da、5257Da、8132Da这6个蛋白均存在差异，可能这6个蛋白是膝骨性关节炎特有的差异蛋白，可用于膝骨性关节炎的临床诊断。并且肝肾亏虚型膝骨性关节炎患者与气滞血瘀型膝骨性关节炎患者相比也有5个显著性差异蛋白，可用于气滞血瘀型膝骨性关节炎与肝肾亏虚型膝骨性关节炎的区分。

根据以上研究，说明这些蛋白质含量的改变很可能与气滞血瘀型膝骨性关节炎与肝肾亏虚型膝骨性关节炎存在重要的相关性，但是尚无证据说明这些蛋白质的改变与气滞血瘀型膝骨性关节炎与肝肾亏虚型膝骨性关节炎是否有相关性或因果关系。目前对于这些差异蛋白正进行质谱鉴定，并搜索相关数据库以进一步了解他们的生物学功能以及他们与气滞血瘀型膝骨性关节炎与肝肾亏虚型膝骨性关节炎是否存在内在的关系。