白细胞介素

作者：周勇安，刘锟，谷仲平，张涛 【关键词】 肺移植

Study of protective effect of interleukin10 on ischemia/reperfusioninduced lung injury following lung transplantation

【Abstract】 AIM: To investigate the protective effects of Interleukin10 (IL10) on ischemia/reperfusion (I/R)induced lung injury following rat lung transplantation and to explore its mechanisms. METHODS: Thirtysix SD rats were randomly divided into 3 groups with 12 rats in each group: sham operation group (control), lung transplantation group and IL10 treatment group. IL10 was administered to the recipient rats through intratrachea way. The wet/dry ratio of lung, lung permeability index and neutrophil percentage in bronchoalveolar lavage fluid (BALF) were detected. The serum level of tumor necrosis factor α（TNFα）was detected by enzymelinked immunosorbent assay (ELISA). RESULTS: The wet/dry ratio of lung, lung permeability index and neutrophils percentage in BALF of I/R group were (657±089),（2349±513）×10－4 and (4984±653)％, significantly higher than those of the control group（P001）. The administration of IL10 to recipient rats before the operation markedly reduced the indexes above to (423±058), （1596±304）×10－4 and (2033±426)％, respectively（P001）. The serum level of TNFα（μg/L）increased to (086±011) after lung transplantation, markedly higher than that of control group, however, the IL10 treatment could reduce its level significantly to ［(039±005),P001］. CONCLUSION: IL10 protects the lung function against I/R injury after transplantation, which is related to its inhibition of TNFα release and activation of neutrophils.

【Keywords】 lung transplantation;reperfusion injury; interleukin10

【摘要】 目的： 探讨白细胞介素10（IL10）对大鼠移植肺再灌注损伤的保护作用及机制. 方法： 将SD大鼠36只随机分为3组，每组12只，即假手术对照组（Control）、肺移植组和肺移植加IL10处理组. 观察受体气管内滴入IL10对移植肺再灌注损伤的保护作用. 肺功能指标包括血氧分压、肺湿干重比、肺通透性指数、支气管肺泡灌洗液（BALF）中白细胞计数和分类；ELISA法检测受体血清中肿瘤坏死因子α（TNFα）含量. 结果： 肺移植术后1 h，肺湿干重比、肺通透指数和BALF中中性粒细胞百分比分别为(657±089)、（2349±513）×10－4和(4984±653)％，显著高于对照组(P001)，经气管内给予受体大鼠IL10可明显降低上述指标至(423±058)、（1596±304）×10－4和(2033±426)％(P001)；肺移植组血清TNFα含量（μg/L）为(086±011)，较对照组显著升高（P001），IL10可明显降低血清TNFα水平至［(039±005),P001］. 结论： IL10对移植肺缺血/再灌注损伤有显著的保护作用，与其抑制中性粒细胞激活和炎性因子TNFα分泌有关.

【关键词】 肺移植；再灌注损伤； 白细胞介素10

0引言

肺缺血/再灌注(I/R)损伤是肺移植术后移植肺功能障碍的主要原因, 而肺对I/R损伤较其他实质性脏器更为敏感，这也使肺移植的发展远远落后于心脏、肝脏和肾脏移植. 因此，改善移植肺I/R损伤，保护肺功能，是促进肺移植迅速发展的关键所在. 白细胞介素10（IL10）是一种由多种细胞生成的具有广泛生物学活性的细胞因子，可以调节T细胞、B细胞和肥大细胞等分化发育，在炎症、免疫反应、病毒感染等过程中均发挥重要作用. 研究表明，IL10可发挥抗炎作用，一方面抑制炎性细胞的激活、迁移与黏附，另一方面抑制炎症因子的合成与释放［1］. IL10对器官移植后再灌注损伤有无保护作用目前尚未见报道.我们在大鼠肺移植手术模型的基础上，观察受体气管内滴注IL10对大鼠移植肺再灌注损伤的保护作用，并初步探讨其机制，以期为临床上移植肺I/R损伤的防治提供新的治疗策略.

1材料和方法

11材料成年SD雄性大鼠24只，体质量220～260 g（由第四军医大学实验动物中心提供）. 随机分为3组，每组12只，即假手术对照组（Control）、肺移植组和IL10+肺移植组. 大鼠TNFα ELISA检测试剂盒为美国Endogen公司产品，IL10购于Boehringer公司.

12方法

121大鼠肺移植手术供体鼠以50 g/L氯胺酮（150 mg/kg）ip麻醉. 经口气管插管，动物呼吸机控制呼吸.尾iv 1 000 U肝素，开胸游离左肺门，于肺处于半膨胀状态时于远端结扎左主支气管. 4℃灌注液灌洗至移植物完全变色，自肺静脉流出液呈无色透明后，将支气管，动、静脉尽可能地远离左肺切断，剪除周围组织，取出左肺浸泡于灌洗液中. 修剪肺动、静脉并分别套管，自动脉以灌洗液冲洗，检查动、静脉是否通畅. 受体大鼠麻醉及插管方法同供体，开胸后游离左肺动、静脉及左主支气管，以血管夹夹闭动静脉，靠远端切断，以肝素冲洗供、受体动静脉残端. 将套管套入受体血管腔内，以丝线结扎固定，从而完成血管吻合. 依次开放静脉和动脉，可见移植肺血液充盈自白色变至红色，动、静脉均充盈呈暗红色. 将受体的左主支气管末端翻转至套管上并以丝线结扎固定，套入供体的左主支气管，经固定后分别剪去支气管两端结扎线，移植肺逐渐扩张自红色变至粉红色，使移植肺完全扩张后纳入胸腔. 吻合满意标准为移植肺充气及弹性回缩好，呈粉红色，肺动静脉充盈好，吻合口无漏血，气管不漏气.以湿纱布覆盖胸腔. IL10处理组在肺移植手术前给予受体气管内滴注IL10 4000 U（溶于05 mL生理盐水）. 移植肺再灌注60 min后结束实验.

122肺组织湿干重比的检测实验结束后半数动物取部分左肺组织，用滤纸吸净表面液体，以分析天平称取湿重，再置入80℃的烤箱中，24 h 后称取干重，二者之比为肺湿干重比.

123肺通透指数测定其余半数动物于实验结束后抽取动物肺动脉血，离心制备血清；以Hanks液5 mL经左主支气管灌洗，反复3次，收集支气管肺泡灌洗液（BALF），采用考马斯亮蓝蛋白测定法检测BALF上清及血清中蛋白浓度，BALF中蛋白浓度与血清蛋白浓度之比为肺通透性指数.

124BALF中白细胞计数取1 mL BALF液离心，将其沉渣涂片，瑞氏染色，光镜下计数BALF中的白细胞数量及中性粒细胞百分比.

125血清TNFα含量的检测将上法制得血清部分置-20℃保存，待所有实验结束后，采用双抗体夹心ELISA法检测血清TNFα含量. 操作按照试剂盒说明进行.

统计学处理： 所有数据均以x±s表示，组间比较采用SPSS110统计软件进行方差分析，两两比较采用LSDt，方差不齐时，组间比较采用非参数秩和检验，P<005表示有统计学意义.

2结果

21肺组织湿干重比及肺通透指数检测结果肺移植组肺湿干重比和肺通透指数显著高于对照组(P001)，IL10处理组上述两指标均显著低于单纯肺移植组（P001，Tab 1）.

表1肺组织湿/干重比和肺通透性指数　略

22BALF中白细胞数和血清TNFα含量肺移植组BALF中白细胞数和中性白细胞百分比较正常对照组显著增高(P001)，血清中TNFα含量也显著高于对照组(P001)；IL10处理组BALF中白细胞数和中性白细胞百分比较单纯肺移植组明显降低(P001)，血清中TNFα含量也显著低于肺移植组（P001, Tab 2）.

表2BALF中白细胞数、中性粒细胞百分比和血清TNFα含量　略

3讨论

随着医学的发展，肺移植的存活率得到明显的改善. 但由于肺耐受缺血时间较其他实体器官短，因而I/R损伤已经成为肺移植术后高死亡率的主要原因之一，阐明其发生机制并寻求相应的治疗措施是当今医学界亟待攻克的一项重要课题.

肺毛细血管通透性增高是肺I/R损伤后的基本病理改变，表现为血管内液渗出增多，有大量蛋白漏出，可检测到肺湿干重比增加，肺通透性指数即BALF与血清中蛋白浓度之比增高，因此，肺湿干重比及肺通透性指数是常用来作为评价肺I/R损伤的基本指标. 我们在肺移植后1 h 检测到肺湿干重比及肺通透指数均较对照组明显增高，而给与受体大鼠支气管内滴注IL10可明显减轻移植肺损伤，表现为使肺湿干重比及肺通透指数显著下降.

缺血再灌注损伤的机制之一是过度的炎症反应，其中TNFα是主要的致炎因子［2］，参与机体炎症反应和免疫反应全过程. I/R损伤后，TNFα的释放可激活多形核白细胞（PMN），增加白细胞、内皮细胞黏附分子的表达，促进白细胞黏附于毛细血管或小血管壁，促进中性粒细胞的聚集和激活间质组织释放蛋白水解酶，使细胞膜损伤和细胞自融，这是引起肺I/R损伤的主要原因之一. IL10是人体内自然产生的抗炎介质，具有多种抑制性效应，可广泛抑制炎症介质，抑制肺内中性粒细胞聚集及脱颗粒，重建体内炎症介质及抗炎介质的平衡［3］. 本实验结果表明，给与IL10治疗后，受体大鼠血清中TNFα含量明显减低，BALF中白细胞总数及中性粒细胞百分比较单纯肺移植组亦显著降低，表明IL10对肺损伤的保护作用与其抑制TNFα产生或释放以及中性粒细胞的浸润和激活有关.

已有研究表明，IL10可广泛抑制免疫效应分子产生，是细胞因子合成的抑制因子［4，5］，其抗免疫排斥反应的作用已越来越受到重视. 本实验结果提示IL10还可通过抑制炎性介质的释放而减轻大鼠移植肺缺血/再灌注损伤，因此，IL10在器官移植领域具有重要的意义，其作用机制值得进一步研究.

【参考文献】

［1］ 夏春芳, 霍勇. 白细胞介素10的细胞生物学效应及其信号转导［J］. 国外医学免疫学分册，2001;24(5): 269-272.Xia CF, Huo Y. The cytobiological effects and signal transduction of interleukin10 ［J］. Foreign Med Fascic Immunol, 2001; 24(5):269-272.

［2］ Yao YM, Yu Y, Wu Y, et al. The role of gut as a cytokinegenerating organ in remote organ dysfunction after intestinal ischemia and reperfusion ［J］ . Chin Med J, 1998; 111(6):514-518.

［3］ Lubberts E, Joosten LA, Helsen MM, et al. Regulatory role of interleukin 10 in joint inflammation and cartilage destruction in murine streptococcal cell wall (SCW) arthritis. More therapeutic benefit with IL4/IL-10 combination therapy than with IL10 treatment alone ［J］ . Cytokine, 1998; 10(5):361-369.

［4］ Minguela A, Torio A, Marin L,et al. Implication of soluble and membrane HLA class I and serum IL10 in liver graft acceptance ［J］.Hum Immunol, 1999; 60(6):500-509.

［5］ Conti F, Boulland ML, LeroyViard K, et al. Low level of interleukin 10 synthesis during liver allograft rejection ［J］ . Lab Invest, 1998; 78(10):1281-1289.